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新孢子虫病（neosporosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生在动物细胞内的原虫病。该病在世界范围内流行广泛，主要临床症状是引起孕畜流产、死胎、弱胎，给养殖业带来经济损失。目前还没有有效的预防新孢子虫病的特效药物和疫苗来控制新孢子虫病的发生。对新孢子虫病作出早期诊断，及时隔离淘汰患病牛是避免新孢子虫病大范围流行的主要方法，此外对新孢子病疫苗的研究也是当务之急。本研究基于新孢子虫NcGRA2的研究，利用NcGRA2重组蛋白建立对新孢子虫病早期诊断的间接ELISA方法，并制备新孢子虫NcGRA2重组蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗，验证联合免疫对BALB/c鼠的保护效果，为预防新孢子虫病的发生提供科学基础。 根据新孢子虫NcGRA2基因序列，设计了一对引物，引物中含有EcoRI和XhoI酶切位点。提取新孢子虫Nc-1株总RNA，用RT-PCR扩增NcGRA2完整ORF基因片段。进行T-A克隆，把NcGRA2连接到T-vector pMD20载体上，获得重组质粒pMD20T-NcGRA2，经酶切鉴定确定阳性克隆。经过测序和生物学分析，表明Nc-1株的NcGRA2基因与Ncliverpool株的序列100％一致，与弓形虫TgGRA2氨基酸同源性49%。通过对NcGRA2基因编码氨基酸进行预测，表明NcGRA2蛋白具有良好的抗原性，稳定性好，亲水性好，有利于蛋白质纯化。 设计一对去掉新孢子虫 NcGRA2基因 N端信号肽的引物用于扩增NcGRA2t，以pMD20T-NcGRA2为模板进行PCR扩增，将NcGRA2t连接到原核表达载体 pGEX-4T1上，构建原核表达载体。经过大肠杆菌中诱导表达，SDS-PAGE分析，表明 NcGRA2t蛋白在培养物上清和包涵体内都存在。经过Western blot分析NcGRA2t蛋白能够被犬感染新孢子虫血清所识别。把NcGRA2t蛋白给BALB/c鼠注射制备了抗NcGRA2t多克隆抗体，经试验NcGRA2t多克隆抗体能与新孢子虫的裂解抗原反应，但是不与弓形虫裂解抗原反应。 基于 NcGRA2t作为诊断抗原建立诊断新孢子虫病的间接 ELISA方法。NcGRA2t诊断抗原能检测到感染新孢子虫的鼠血清，不和感染弓形虫的鼠血清反应，表明ELISA方法能区别新孢子虫感染和弓形虫感染。NcGRA2t作为诊断抗原和NcSAG1t诊断抗原进行了比较，对犬感染新孢子虫血清进行检测，显示NcGRA2t作为诊断抗原的间接ELISA方法能用于新孢子虫病的早期诊断。应用该 ELISA方法对现地样本进行了检测，生活在牧场的犬感染新孢子虫的几率要高于宠物犬。应用NcGRA2t和NcSAG1t作为诊断抗原对某牧场的牛血清样本进行了检测，用NcGRA2t诊断牛感染新孢子虫的阳性率为15%，用NcSAG1t诊断牛感染新孢子虫的阳性率为50%，其中NcGRA2t诊断为阳性的牛血清样本全部为NcSAG1t诊断阳性。 用EcoRI和XhoI酶从pMD20T-NcGRA2载体上切下NcGRA2片段连接到真核表达载体pcDNA3.1上构建pcDNA3.1/NcGRA2重组质粒。pcDNA3.1/NcGRA2经过脂质体转染到293细胞内，通过间接荧光抗体试验能够检测NcGRA2蛋白的表达，说明pcDNA3.1/NcGRA2能在哺乳动物细胞内表达外源蛋白，为新孢子虫NcGRA2核酸疫苗研究奠定了基础。 应用NcGRA2t重组蛋白疫苗和pcDNA3.1/NcGRA2核酸疫苗给BALB/c鼠免疫，能诱导小鼠产生IgG、IgG1和IgG2a体液免疫应答，IFN-γ和IL-4细胞免疫应答，诱导机体产生Th1/Th2型免疫应答，并且能减轻新孢子虫对小鼠脑部的感染。