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第一章重组脑源性神经营养因子真核表达载体构建目的：构建pegfpN1-BDNF真核表达载体,为体外构建基因工程细胞奠定基础。方法：RT-PCR扩增人胚胎脑组织脑源性神经营养因子(BDNF)基因片段,将基因片段与pegfpN1质粒连接制成重组质粒。转化、筛选及扩增重组质粒,用EcoR I和BamH I酶切分析鉴定BDNF是否插入重组质粒。小量提取重组质粒后进行测序分析,将酶切检测和测序正确的pegfpN1-BDNF重组质粒用QIAGEN-TIP100大量提取。结果：经酶切鉴定,成功地将BDNF与pegfpN1质粒连接,构建我们需要的pegfpNl-BDNF重组质粒。结论：成功构建了pegfpN1-BDNF重组真核表达载体,为体外实验做好准备。第二章脑源性神经营养因子修饰的骨髓间充质干细胞的构建及诱导分化成神经元样细胞电生理特性的初步研究目的：在体外构建能过表达BDNF的骨髓间充质干细胞(BMSCs),并诱导该基因工程细胞转分化为神经元样细胞,经膜片钳检测诱导分化细胞的电生理特性。方法：采用梯度密度离心法及贴壁法分离培养原代BMSCs,取第二-三代细胞,流式细胞仪鉴定分离培养细胞表面标志物CD34、CD44、CD45表达情况。将重组真核表达载体pegfpN1-BDNF及pegfpN1分别通过电穿孔的方法转染入BMSCs中,瞬转48小时后流式细胞仪检测细胞瞬时转染效率。经G418筛选,流式细胞仪检测转染效率。采用全反式维甲酸诱导BDNF-BMSCs、BMSCs向神经元样细胞转化,细胞免疫荧光鉴定诱导后细胞神经特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)以及BDNF的表达情况。采用全细胞膜片钳记录诱导后BDNF-BMSCs的生物电特性的变化,并与未分化的BMSCs对比。结果：经流式细胞仪鉴定,所分离细胞表面标志物CD34、CD45、CD44阳性表达率分别为3.19%、4.42%、96.82%,证明了分离的细胞为BMSCs。电穿孔法BMSCs的瞬转率为10%-15%,经G418筛选,其转染率达到70%-80%。经全反式维甲酸诱导后BDNF-BMSCs组表达NSE.GFAP分别为45.87±5.82%,21.92±2.29%,未诱导BDNF-BMSCs组分别为23.90±6.95%,10.23±2.08%,而诱导的BMSCs组为4.81±1.71%,1.93±1.34%。在检测的15个诱导的BDNF-BMSCs中,膜片钳检测到7个细胞有似钠离子内向电流产生,与对照组比较两组差别有统计学意义(P<0.05)。结论：BMSCs易分离及培养。用电穿孔法可以建立起体外稳定高效表达BDNF的组织工程细胞BDNF-BMSCs,经诱导可以转分化为具有一定神经元细胞电生理特性的神经元样细胞。第三章基因工程细胞经不同途径移植入正常听力豚鼠耳蜗内的比较及长期安全性的观察目的：比较经鼓阶与蜗轴两种不同细胞移植途径的特点,同时长期观察BMSCs在内耳的分布及生长情况,为将来临床细胞移植奠定基础。方法：选取40只听力正常豚鼠,术前听力均经听性脑干诱发电位(auditory brainstem response audiometry, ABR)检测鉴定。40只豚鼠分为2组每组各20只。Ⅰ组为经鼓阶注射组,Ⅱ组为经蜗轴注射组。将Egfp-BMSCs作为移植细胞注入,术后设3个时间点测试术耳4KHZ、8KHZ、16KHZ的ABR阈值,3个时间点分别为术后7天、术后28天、术后42天。在测试ABR后,在每个时间点每组处死5只豚鼠,取耳蜗做冰冻切片观察移植细胞在耳蜗内的分布情况。其余10只豚鼠于术后6个月处死,观察耳蜗大体标本并做石蜡切片,观察其形态学改变。结果：Ⅰ组豚鼠术耳术后7天各个频率ABR阈值较术前均有提高,术后28天恢复到术前水平,术后42天检测ABR阈值无提高。Ⅱ组豚鼠术耳术后7天各个频率ABR阈值明显提高,术后28天检测ABR阈值无下降,术后42天检测ABR阈值无改变。冰冻切片显示：鼓阶注射方式,移植细胞分布于鼓阶、前庭阶、中阶,在蜗轴未发现明显移植细胞。蜗轴注射方式,移植细胞分布于蜗轴、鼓阶、前庭阶、中阶。随着观察时间的延长,在耳蜗的移植细胞逐渐减少,42天后未见明显移植细胞。细胞移植术后6个月耳蜗大体无明显异常,未见移植细胞过度生长致肿瘤形成,石蜡HE染色切片观察耳蜗结构无明显异常。结论：鼓阶注射对耳蜗创伤较小,是比较安全的注射方式。蜗轴注射对耳蜗创伤较大,但其移植细胞可在靶区定植。移植细胞在耳蜗内能存活28-42天,BMSCs移植耳蜗内未见致瘤性。第四章BDNF基因修饰的BMSCs在致聋豚鼠耳蜗内的表达与分化及对螺旋神经元的保护作用目的：观察BDNF-BMSCs移植入损伤耳蜗后,移植细胞是否在体内分化成神经元样细胞,并观察其对SGNs的保护作用。方法：45只氨基甙类抗生素致聋模型豚鼠分为三组。三组动物经鼓阶途径注入不同成分,A组为人工外淋巴液组；B组为体外诱导分化的BDNF-BMSCs组；C组为未诱导的BDNF-BMSCs组。在术后7天、28天、42天处死动物,取耳蜗组织石蜡包埋切片。BDNF抗体免疫组化确定移植细胞分泌情况,NSE和GFAP抗体免疫组织化学检测移植细胞发生分化情况,用平均光密度(average optical density, AOD)分析免疫化学结果及SGNs密度。结果三组动物均造模成功,ABR阈值大于75dB SPL。NSE和GFAP免疫组织化学可见B组、C组染色AOD值均大于A组(P<0.05),B组AOD值大于C组(P<0.05)。SGNs密度B组、C组高于A组,而B组、C组SGNs密度比较无统计学意义(P>0.05)。随着时间的延长其移植细胞数量减少,术后42d耳蜗内未见明显移植细胞。结论BDNF-BMSCs在耳蜗内能转化为神经元样细胞,并存活28-42d。BDNF-BMSCs对SGNs有保护作用。耳蜗内移植在体外诱导分化的BDNF-BMSCs与未经诱导分化的BDNF-BMSCs对损伤的SGNs都具有保护作用。