红树林暹罗克鲁维酵母HN12-1菌株新型嗜杀因子的研究

来源 :中国海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jeffyi2009
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暹罗克鲁维酵母(Kluyveromyces siamensis)HN12-1是一株从红树林生态系统中分离的嗜杀酵母,可以分泌嗜杀因子,对梭子蟹“乳化病”的病原菌尾丝梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata) WCY菌株具有杀灭作用。HN12-1菌株产嗜杀因子的最适条件为25℃条件下,在含有0.5%NaCl的YPD培养基(pH4.0)中培养。通过离心、沉淀、凝胶过滤层析、DEAE-Sepharose FastFlow离子交换层析,我们从HN12-41菌株培养上清中纯化了嗜杀因子。25℃条件下,纯化的嗜杀因子在检测培养基(YPD,不含NaCl,pH4.0)上可以对梅奇酵母WCY菌株产生最大嗜杀活性。通过SDS-PAGE电泳发现,纯化浓缩的嗜杀因子条带单一,分子量约为66.4KDa。质谱分析(MALDITOF/TOF)发现,该嗜杀因子中多肽片段与茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)脂肪酶同源性很高,相似指数为89。通过对梭子蟹中10种病原酵母和病原细菌嗜杀作用的研究发现,HN12-1菌株产生的嗜杀因子仅对尾丝梅奇酵母WCY菌株具有杀灭作用。HN12-1菌株的嗜杀因子通过两步发挥嗜杀作用:首先嗜杀因子与细胞壁上的受体合,然后破坏细胞膜从而杀死敏感细胞。该嗜杀因子的细胞壁受体可能是几丁质。底物竞争性研究表明,几丁质可以保护敏感细胞不受嗜杀因子的影响,而其他多糖不能。敏感细胞经嗜杀因子处理以后,扫描电镜结果显示细胞表面受到破坏并伴随着细胞内容物的破裂和释放,而对照组细胞表面平滑,说明嗜杀因子处理会导致细胞壁的崩解。同时,采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4P,6-diamidino-2-phenyl-indole,DAPI)和碘化丙啶(Propidium iodide,PI)对嗜杀因子处理过细胞进行染色,结果显示敏感酵母细胞可以很快被嗜杀因子杀死,表明嗜杀因子会引起细胞膜功能的破坏。嗜杀因子致死活性研究表明嗜杀因子的浓度与死亡细胞的比例成正相关。嗜杀因子可以在30min内发挥致死作用,其最小致死浓度和致死时间分别为40μg/ml和36h。将敏感酵母(尾丝梅奇酵母WCY菌株)和嗜杀酵母(暹罗克鲁维酵母HN12-1菌株)共培养,对敏感细胞的浓度、细胞的营养状况和HN12-1菌株产嗜杀因子情况之间的关系进行研究,结果表明当敏感细胞浓度低于1.0×103cells/ml时,嗜杀酵母生长状况良好,嗜杀因子的产量也比较大,培养基中敏感酵母死亡细胞的比例上升,敏感细胞生长情况较差;然而,当敏感细胞的浓度大于1.0×103cells/ml时,情况则好相反,嗜杀酵母生长状况较差,嗜杀因子产量很低,敏感酵母死亡细胞的比例下降,培养基中蛋白含量降低,敏感酵母细胞生长状况良好。研究还发现,在富营养和低营养培养基中,细胞生长状况比在蒸馏水中要好很多,嗜杀因子产量也更好。本论文首次报道了红树林暹罗克鲁维酵母HN12-1菌株对尾丝梅奇酵母WCY菌株的嗜杀活性,目前的研究表明该新型嗜杀因子具有潜在的应用价值。
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