论文部分内容阅读
研究背景：随着国家大力推行新生儿接种乙肝疫苗的策略，我国乙型肝炎的流行得到了有效的控制，尤其是对儿童的预防起到了至关重要的作用。但仍有部分免疫儿童感染HBV，而儿童感染HBV易发展成为持续性和慢性非活动性感染，甚至肝细胞癌，成为潜在传染源。免疫儿童感染HBV的机制较复杂，所感染的HBV基因组变异是其中主要原因之一。目前对儿童感染的HBV基因组的分子特征研究较少，江西地区乙肝疫苗免疫儿童感染的HBV基因组的分子特征及变异分析未见报道。研究目的：本研究拟从江西地区采集儿童感染的血清样本，扩增HBV全基因组DNA并测序，对HBV基因组各开放读码框的变异进行初步分析，以阐述免疫儿童感染HBV的病原分子特征，为预防和治疗儿童感染HBV提供病毒学分子信息。研究方法：1.标本的采集及初筛：留取2012年1月到2012年12月在江西省儿童医院门诊、住院及体检的乙肝疫苗全程免疫患儿血清，酶联免疫吸附方法（ELISA）检测HBV-M，筛选出HBV感染的阳性血清标本。2.全基因组DNA扩增和测序：采用三对重叠引物对HBV全基因组DNA进行高保真PCR扩增并测序。3. HBV基因及氨基酸序列的比对:利用Clustal X和Bioedit软件将所获得HBV全基因组的4个编码区的核苷酸和氨基酸序列与参考序列进行比对，分析主要及有意义的变异位点。4.构建HBV基因系统进化树并判定基因型：利用DNAstar、Clustal X和Mega4软件对不同基因型以及标本的S基因序列构建进化树，以儿童标本与已知基因型序列在进化树中所处的遗传进化关系作为分型依据，判定儿童感染的HBV的基因型。5.基因亚型和血清型的确定：利用Clustal X软件和Bioedit软件对B基因型各亚型及标本S基因的核苷酸序列做同源性比较以确定HBV的亚型。同时依据S基因S区第122位和160位的赖氨酸（K）/精氨酸（R）判断d/y，w/r的亚型标准，判定所测标本的血清型。研究结果：1.标本收集:共收集乙肝疫苗全程免疫儿童（7.83±3.51岁）血清标本11445份，男童6282人（54.89%），女童5163人（45.11%）。获得HBV-M阳性血清标本117份。2.全基因组序列测序与分析：对HBsAg阳性标本进行分段重叠扩增并测序，最终拼接出58份完整的HBV基因组。对各开放读码框分别进行序列比对发现S-ORF，C-ORF，P-ORF和X-ORF的氨基酸突变率分别为5.50%（22/400），2.36%（5/212），3.91%（33/843）和12.99%（20/154）。各ORF突变情况如下：①S-ORF中Pre-S1区N端主要的突变点及其突变率为：G2938C→D31H（5/58,8.62%）、A2990C→H48P（11/58,18.97%）、A2999C→N51T（12/58,20.69%）、C3041T→P65L（10/58,17.24%）、C3050T／C3051T→T68I（6/58,10.34%）、G3065T→G73V（5/58,8.62%）、C3097A→L84I（20/58,34.48%）、G3109A→V88M（6/58,10.34%）和A3136G→T97A（11/58,18.97%）。S区突变区域集中在120aa-200aa，主要的突变点及其突变率为： C533A→P127T （5/58,8.62%）、 A541C→Q129H（3/58,5.17%）、G588C→G145A（3/58,5.17%）、T753A→F200Y（18/58,31.03%）。②C-ORF中前C区主要突变点及其突变率为： A1814C／T1815C→M1P（8/58,13.79%）、G1896A→W28*（1/58,1.72%）。C区出现一例C1913A→P5T（1/58,1.72%）变异；③P-ORF出现散在分布的突变位点，未发现与耐药性有关的突变位点，其RT区YMDD核序也未发生变异。④X-ORF氨基端主要突变点及其突变率为： G1437T/A→G22C/S （14/58,24.14%）、 G1476A→G35R（12/58,20.69%）和G1503A/T/C／T1504G→V44I/F/L/C（31/58,53.45%）。羧基端突变集中在120aa-150aa，主要的突变点及其突变率为： G1752A／T1753C→V127I/T （14/58,24.14%）、 A1762T→K130M （5/58,8.62%）、G1764A→V131I（5/58,8.62%）、T1800C→C143R（29/58,50%）、C1807G→P145R（29/58,50%）、G1809T／C1810G／A1811T→A146C/G（29/58,50%）、T1815C／G1816A／C1817T→C148R/H （29/58,50%）、 A1819G／C1820A→D149G（19/58,32.76%）。3.基因型和血清型分析：本研究中获得的58份儿童HBV基因序列均为B基因型。进一步和B基因型各亚型做核苷酸同源性比对，结果与B2亚型的同源性最高，在99.0%~99.6%之间，标本属于B2亚型。根据S基因S区第122位和160位的氨基酸判定58份标本血清型为adw型。研究结论：1.本研究成功获得了江西地区儿童感染的HBV全基因组序列，初步分析了儿童感染的HBV基因组的突变与分子特征。2. S基因中的某些突变位点可能改变病毒的某些生物学性质，如感染性、抗原性和免疫原性，是HBV免疫逃逸和持续感染的分子机制之一。3.C基因某些位点突变可能改变了HBeAg和HBcAg在宿主内的表达加工及分泌特征，同时也可能对宿主抗HBcAg的细胞免疫反应产生了下调作用，是导致儿童HBV慢性感染的分子与免疫调节机制之一。4. X基因氨基酸突变率较高，多个突变位点的HBx影响HBV的复制及表达的反式调节，在儿童HBV慢性感染起一定的作用。5.江西地区儿童HBV以B基因型为主，且以B2亚型占主导。血清型以adw型为主。