[背景与目的]肝纤维化(HF)是指在各种致病因素的作用下,肝内弥漫性细胞外基质过度沉积的病理过程。在此过程中,多起源的肌成纤维细胞(MFB)的活化与增殖是HF发病的关键环节。既往一直认为肝星状细胞(HSC)是MFB的主要来源。最新研究发现肝细胞在肝纤维化发生时也可经上皮间质转化(EMT)途径转变为MFB,并参与胶原的合成。大量研究确证姜黄素在保护肝细胞、抑制肝纤维化方面具有突出作用,并可通过调控TGF-β/smad、Hedgehog等信号通路相应分子的表达抑制肾小管上皮细胞与肿瘤细胞EMT。本项目旨在探讨:1)肝纤维化过程中是否发生了肝细胞的上皮间质转化;2)姜黄素是否可通过抑制缺氧诱导肝细胞的上皮间质转化过程进而逆转肝纤维化发病进程,其具体机制又是如何?本研究对于深入了解肝纤维化发病机制及丰富姜黄素的研究基础具有一定的意义。[研究方法]本研究采用体内外研究相结合的方法,以及运用分子生物学手段对药物作用分子机制进行了深入探讨。1)体内研究部分:我们采用CC14致大鼠肝纤维化模型,姜黄素不同剂量(100、200、400 mg/kg)干预处理,检测各组肝组织病理学改变;免疫荧光检测肝组织中Vimentin和Collagen I的表达情况;进一步利用Western Blot检测肝组织中Vimentin、Collagen I和α-SMA的蛋白表达情况。2)体外研究部分:应用缺氧模拟剂(CoCl2)构建缺氧诱导人肝细胞L02上皮间质转化模型;采用细胞划痕实验与Transwell细胞迁移实验检测姜黄素对缺氧诱导人肝细胞L02运动与迁移能力的影响;Western Blot与细胞免疫荧光检测检测姜黄素不同浓度(10、20、30 μM)对缺氧诱导的 L02 细胞表达 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Collagen I 和 α-SMA蛋白的影响;显微镜下观察姜黄素(30μM)作用不同时间对缺氧诱导L02细胞形态学的影响。3)分子机制探讨部分:我们应用Western Blot检测了姜黄素对上皮间质转化调控密切相关的TGF-β、Wnt及HGF信号通路相关蛋白表达的影响。[研究结果]与正常组相比,模型组的纤维化程度明显加重,肝脏炎症坏死区及纤维间隔明显增多。同时免疫荧光结果显示模型组肝细胞Vimentin与Collagen I的表达量明显升高。姜黄素则能够抑制CC14导致的肝脏病理学的改变,并能抑制肝组织中Vimentin、Collagen I和α-SMA的蛋白表达,且具有一定剂量依赖关系(P<0.05)。缺氧模拟剂CoC12在l00μM以下对L02的增殖活性都没有明显的影响,同时Eilsa结果显示CoC12浓度在400μM以下对L02功能的影响与对照组相比没有统计学差异(P>0.05)。CoCl2(100μM)作用72h能够诱导L02细胞出现明显的间质化细胞特征。Western Blot结果显示缺氧诱导能够降低上皮型标志蛋白E-cadherin的表达,升高间质型标志蛋白N-cadherin和Vimentin的表达,并能使L02细胞表达纤维化标志蛋白Collagen I和α-SMA的表达。姜黄素自身在70μ 以下对细胞的增殖是没有影响的。姜黄素与缺氧模拟剂(CoC12,100 μM)同时作用与L02细胞时,姜黄素浓度在50μM以下对细胞的增殖是没有抑制作用的。细胞划痕与transwell实验表明姜黄素能够抑制缺氧诱导的肝细胞L02的水平与垂直迁移运动。姜黄素能够抑制上皮型标志蛋白E-cadherin的表达,且能升高间质化标志蛋白N-cadherin、Vimentin及纤维化标志蛋白Collagen I和α-SMA的表达,并呈现剂量依赖性的关系。姜黄素(30 μM)能够抑制缺氧诱导的L02细胞形态学的间质化转变。免疫荧光结果显示姜黄素能够抑制纤维化标志蛋白α-SMA的表达及形态学的间质化转变。Western Blot结果显示姜黄素对Wnt影响较小,但能升高GSK-3β并降低β-catenin的蛋白表达。同时姜黄素能够抑制TGF-β信号通路下游信号分子Smad 2、Smad 3的蛋白表达,但通过阻断TGF-βR研究发现姜黄素抑制缺氧诱导肝细胞上皮间质转化的效应并不完全依赖TGF-β信号通路。姜黄素能够上调缺氧诱导的肝细胞中HGF及c-met的蛋白表达。[结论和意义]在肝纤维化发生时,肝细胞能够通过上皮间质转化途径转变为肌成纤维细胞,参与并增加细胞外基质的合成与沉积。姜黄素能够抑制缺氧诱导肝细胞上皮间质转化进程,减少细胞外基质的生成。这种作用可能是由于姜黄素调控了 TGF-β、Wnt及HGF/c-met信号通路相关蛋白的表达。我们的研究为姜黄素治疗肝纤维化的作用及作用机制提供了一个新的视角。