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分子识别涉及着几乎所有的生命过程,而多肽和蛋白质之间的特异性相互作用是生物体内分子识别极其关键的一步,因此成为生命科学和化学生物学研究的热点与前沿。本论文围绕多肽和蛋白质之间的分子识别,在正义肽-反义肽相互作用规律研究的基础上,发展了基于反义肽简并性的功能导向筛选新方法,并成功应用于肝癌LAPTM4B蛋白靶向的多肽探针的筛选,以及肝癌细胞特异性识别的研究。主要研究结果如下:
开展了正义肽.反义肽相互作用及其规律的研究,发展了基于反义肽简并性的功能导向筛选新方法。以新的人肝癌标志物LAPTM4B蛋白为靶标,选择其第二胞外区EL2片段为正义肽,以肽链中所处微环境不同的缬氨酸为模型正义氨基酸,根据碱基配对原则和遗传密码的简并性,设计并合成了两组反义肽。构建了以正义肽EL2为配基的高效亲和色谱体系,研究了正义肽.反义肽的相互作用。通过逐步扩展、位置扫描筛选,获得了组氨酸取代的先导序列APlH和优选序列AP2H。与先导肽AP1H相比,优选肽AP2H的亲和力提高了2倍,在生理条件下,与正义肽的平衡解离常数为5.5×10-6 mol/L。两次筛选的结果均显示,组氨酸是缬氨酸的最佳配对氨基酸,表明简并反义肽对正义肽的识别具有规律性,为导向性分子的设计提供了新的启示。
亲和力和特异性是正义肽.反义肽实现生物学效应不可或缺的特性,为此开展了反义肽识别正义肽的特异性研究。基于优选肽AP2H与正义肽EL2的高亲和力,通过分子结构分析,设计并合成了氨基酸组成相同但排序不同的对照肽ROP,以酶联免疫吸附分析(ELISA)和亲和色谱研究了AP2H、ROP与EL2的特异性识别。对照肽ROP与EL2的亲和力大大降低甚至丧失,表明反义肽AP2H与正义肽EL2相互作用的特异性由其一级结构所决定,氨基酸残基的重排导致了分布于肽链上多位点、多种局部作用力协同效应的丢失。ELISA分析证明AP2H能特异性地识别KLH-EL2蛋白质复合结构中的EL2片段,因此具备了识别含有EL2片段的LAPTM4B蛋白,乃至肝癌细胞的潜力。通过与多克隆抗体的比较,证明了AP2H可作为抗体的替代物,在生物分析中彰显其生物相容性好、穿透性强、免疫原性低等优势。
利用激光扫描共聚焦显微镜开展了高亲和力、高选择性AP2H多肽探针对肝癌细胞的靶向识别研究。考察了FITC标记的AP2H探针对肝癌细胞LAPTM4B蛋白的识别、定位与动态分析。结果显示,AP2H多肽探针能特异性地识别模型BEL-7402及HepG2肝癌活细胞。AP2H-FITC与Hoechst33342双染标记分析,以及Z-stack断层扫描分析显示,多肽探针定位于细胞膜以及细胞质,不存在于细胞核,与LAPTM4B蛋白在细胞中的分布情况一致。AP2H多肽探针从细胞膜到细胞质的转位模式表明,其动态分布是由LAPTM4B蛋白所介导的。AP2H多肽探针实现了对LAPTM4B蛋白高表达的人肝癌HepG2-mock细胞和低表达的HepG2-RNAi细胞的准确辨别,确证了其对肝癌细胞的识别是以LAPTM4B蛋白为靶点的。AP2H多肽探针可发展成为一种新型肝癌快速诊断试剂,并作为特异性抗癌药物载体,在肝癌的诊断与治疗中发挥重要作用。
采用直接ELISA分析和竞争抑制ELISA分析,研究了高亲和力的优选肽DP与SARS病毒S蛋白的专一性相互作用及识别位点。亲和肽DP是以S蛋白穿膜肽SP为靶点,从所构建的基于反义肽的组合化学肽库中筛选得到的。直接ELISA结果表明,在生理盐条件下,亲和肽DP与S蛋白呈浓度相关的饱和吸附模式。在竞争抑制ELISA分析中,当竞争剂SP的浓度大于10μg/ml,时,SP对DP与S蛋白的结合产生明显的抑制作用,其半效抑制浓度(IC50)为45μg/ml;而对照蛋白质和对照多肽则不存在类似结果,表明SP的竞争抑制作用具有特异性,并且亲和肽DP对S蛋白的识别是以SP片段为靶点的。因此基于反义肽简并性所构建的组合化学肽库,不仅可以提高筛选效率,而且所获取的多肽能靶向特异性地识别功能蛋白质,进而发挥其生物学效应。