鱼类性别决定具有高度可塑性,性别决定与分化由遗传和环境因素共同决定。在环境因素中,温度变化能够在部分鱼类的性别分化期影响其性腺分化的命运,改变群体性比。同时,在这一时期,硬骨鱼类在卵巢中合成内源性雌激素,并作为卵巢分化的自然引导者。众多研究表明,内源性类固醇激素的变化,甚至可以掩盖遗传因素,改变性腺分化的方向。尼罗罗非鱼是一种性别分化方向受到基因和温度双重影响的鱼类,即在性别分化期,温度能够改变其性别分化的方向,而温度是如何影响其性别分化的,即高温条件下内源雌激素是否通过其水平变化驱动这种分化方向的改变?雌激素的变化水平又如何,具体的分子机制是什么,目前仍不清楚。本研究通过野生雌鱼(XX)与伪雄鱼(XX)杂交,获取了三个尼罗罗非鱼全雌家系。因为Letrozole能特异降低E2的水平,所以为了探究在罗非鱼性腺分化早期,高温处理对性类固醇激素水平与群体雄性率的影响,以及二者的对应关系,分别设置雌鱼对照组,雄鱼对照组,高温36℃处理组(XX+HT)和不同浓度Letrozole处理组,对比分析高温和Letrozole在性别分化早期下调E2水平的能力。结果显示,虽然在高温处理早期(13dpf)罗非鱼性腺内E2和11-KT水平均未发生改变,但是在21dpf,高温显著降低了E2水平,约降低到对照雌鱼E2水平的一半,接近于XX+L1.5组(4μg/L)的E2水平。在各Letrozole组,随着添加Letrozole量的增加,E2水平是逐渐降低的。XX+HT组与各Letrozole组的E2水平和雄性率进行比较分析表明,高温能下调E2,并且是诱导尼罗罗非鱼雌鱼性逆转的一条重要通路。但是,XX+HT组的E2水平与XX+L1.5组相近,比XX+L4.5组的E2水平高,而雄性率(70%)与XX+L4.5组的雄性率(65.9%)相近,这表明,高温除了下调E2途径,还可能通过其他不同的调控通路参与调控了尼罗罗非鱼雌鱼性逆转,但高温下调E2通路可能是其中一条非常重要的通路。性腺芳香化酶Cyp19a1a是一种类固醇生成酶,负责催化生成雌激素,实验利用原位杂交(ISH),qRT-PCR,免疫组织化学(IHC)及Western blot对尼罗罗非鱼性腺芳香化酶Cyp19a1a mRNA表达及蛋白表达量检测分析。由于性别分化初期罗非鱼性腺组织极小,在qRT-PCR,Western blot实验中每样品分别采用80和30个性腺组织的混池,在ISH,IHC实验中,每组每家系使用8个个体的重复,所有实验都采用三个家系作为三次生物学重复。结果显示,与雌鱼对照组相比,高温处理显著下调了Cyp19a1a mRNA与蛋白的表达水平。对Cyp19a1a启动子区进行亚硫酸氢盐测序,结果显示,在21dpf,高温处理能显著上调尼罗罗非鱼Cyp19a1a启动子区的甲基化水平。此外,应用放射性免疫方法检测了各组的芳香化酶活性,结果显示,与雌鱼对照组相比,高温处理(XX+HT)组性腺芳香化酶活性显著降低。此外,本研究利用同样的方法,对性腺内Dmrt1 mRNA及蛋白表达水平进行分析,结果显示,在高温下,雄性性别分化关键基因Dmrt1 mRNA和蛋白表达水平显著上调。综合以上结果,得出,在性别分化关键期内,高温能通过升高尼罗罗非鱼Cyp19a1a启动子区的甲基化水平,降低Cyp19a1a mRNA和蛋白的表达水平,进而下调了性腺中芳香化酶活性和E2水平,鉴于E2在鱼类性别分化中的关键性作用,推测E2水平的下调可能又间接地上调了Dmrt1 mRNA和蛋白的表达水平,开启了雄性通路,诱导尼罗罗非鱼遗传型雌鱼性逆转为生理型雄鱼。