论文部分内容阅读
背景:多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）是一种中枢神经系统（central nervous system,CNS）自身免疫性脱髓鞘疾病,其主要病理改变包括髓鞘脱失、轴突损伤、胶质细胞活化和神经炎症反应等,机制不清,具有反复发作、多部位损害和影响神经功能等特征,固有免疫和适应性免疫应答异常是诱发该疾病的主要原因。MS早期,外周免疫细胞异常激活,并通过破坏的血脑屏障（blood brain barrier,BBB）进入CNS,产生大量促炎因子和趋化因子,活化CNS中的免疫细胞—小胶质细胞（microglia,MG）,引发CNS炎症。同时,进一步趋化外周更多T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell,DC）等免疫细胞浸润,产生针对髓鞘相关蛋白的异常自身抗体,发生一系列针对髓鞘的病理改变。组织蛋白酶C（Cathepsin C,CatC）属于溶酶体番木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶,是一种分泌性的外切酶,具有独特的二肽肽酶活性,主要表达在淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞等免疫相关细胞中,参加蛋白质降解、蛋白质加工、抗原呈递、细胞凋亡以及肿瘤浸润和炎症反应等。生理条件下CNS中CatC主要在海马齿状回CaⅡ区、嗅球等区域的神经元表达。在我们前期研究中发现,病理条件下CatC可在活化的MG中表达,并可通过自分泌和旁分泌促进MG和巨噬细胞向M1极化,从而加重神经炎症及cuprizone诱导模型的髓鞘脱失。然而,CatC在适应性免疫应答中的作用至今不清。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG）是位于CNS髓鞘最外层的蛋白成分。MOG35-55诱导的实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是利用MOG的35-55肽段免疫动物,诱发免疫反应和髓鞘脱失,与MS具有非常相似的免疫机制,主要表现为:（1）均针对CNS髓鞘蛋白产生免疫攻击;（2）活化的T细胞均包含辅助性T（helper T,Th）细胞;（3）导致病理改变的淋巴细胞均为产生干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白细胞介素12（interleukin 12,IL-12）的Th1细胞和产生IL-17、IL-23、IL-1β的Th17细胞。因此,EAE是国际上公认的研究MS免疫机制的最佳模型。除上述致病淋巴细胞外,Treg和Th2可以抑制Th1和Th17的活动,控制炎症反应;而与生发中心（germinal center,GC）形成、B细胞成熟及抗体产生相关的滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cell,Tfh）也日趋得到重视。目的:探讨CatC对EAE模型神经功能的影响及其相关免疫机制方法:利用C57BL/6J野生型（wild type,WT）和CatC过表达（CatC over expression,CatC OE）的小鼠,建立MOG35-55诱导的EAE脱髓鞘模型,正常C57BL/6J小鼠为空白对照。自免疫当天开始,每天对小鼠称重,观察小鼠状态,并按照EAE模型临床评分标准进行神经功能评分,连续观察48天。在免疫后第7、10、15、23和50天分别提取各组小鼠的脾和引流淋巴结以及血清。利用流式细胞术的方法分析脾脏和淋巴结Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh细胞分化情况;利用酶联免疫吸附实验的方法观察血清内Tfh和T17h相关细胞因子IL-21和IL-17,以及MOG35-55特异性的Ig G抗体的表达情况。采用单因素方差分析和t检验的方法对实验数据进行统计分析,数据用Mean±SEM表示,P<0.05表示统计结果有显著性差异。结果:1.CatC OE加重神经功能损伤。与野生型相比,MOG35-55免疫后CatC OE小鼠发病时间早;神经功能评分无论在急性期（23天）和慢性持续阶段（48天）显著增高,说明CatC加重EAE神经损害。2.CatC OE增加了EAE模型动物脾脏和颈部引流淋巴结中CD4+Th细胞中Th17和Tfh细胞的比例及血清中相关细胞因子IL-17A和IL-21表达。与野生型相比,MOG35-55免疫后CatC OE小鼠脾脏和颈部引流淋巴结中的Th17和Tfh细胞在免疫后第7、10和15天时均显著增高,并伴有血清中的IL-17A和IL-21表达的显著增高;Treg细胞在免疫后第7、10和23天时均显著增高;而Th1和Th2细胞无显著性差异。3.CatC OE促进MOG35-55-特异性Ig G抗体表达显著升高。与野生型相比,MOG35-55免疫后CatC OE小鼠血清里的MOG35-55-特异性Ig G抗体在第10,14和23天显著升高。结论:CatC促进CD4+T细胞向Th17和Tfh细胞分化,并促进其相关细胞因子IL-17和IL-21的表达以及增加MOG35-55-特异性Ig G抗体的产生,从而加重EAE疾病进展。