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胃癌（Gastric cancer）在全球发病率居第四,死亡率居第二,是最常见的恶性肿瘤之一,而幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染已经成为诱发胃癌的高危因素,世界卫生组织（WHO）在1994年将H.pylori定为Ⅰ类致癌因子。我国胃癌发病率很高,年患病率和死亡率是世界水平的2倍还多。大多数胃癌患者确诊时已处于中晚期,并伴有各种转移。其发现晚、难治疗以及死亡率高的一个重要原因就是易侵袭转移,而上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是胃癌侵袭转移的关键机制。Micro RNAs（miRNAs）是一种大小约18-26个碱基的单链小分子RNA,由具有发夹结构的单链RNA前体经Dicer酶加工后生成的,它可在转录后水平调控靶基因的表达。本文主要探讨miR-375在H.pylori感染的胃癌EMT中的作用和机制。目的研究miR-375通过靶向结合JAK2调控H.pylori诱导的胃癌上皮间质转化的作用机制方法1.H.pylori感染胃黏膜细胞模型中差异性miRNAs和m RNA的筛选（1）构建H.pylori感染的胃正常黏膜细胞和胃腺癌细胞模型,利用全转录组测序分析,用火山图推断差异miRNA和m RNA的整体分布情况,然后对差异性表达的miRNAs和m RNA进行聚类分析,筛选出在H.pylori感染的胃黏膜细胞模型中差异表达的miRNAs以及m RNA。（2）immunohistochemistry（IHC）、Immunofluorescence technique（IF）和RT-PCR检测临床胃癌组织中miR-375、AEG-1、JAK2和EMT相关因子和标志物（E-cadherin、Vimentin、Snail）的表达水平。2.miR-375对AEG-1和JAK2基因的靶向关系（1）通过miRWalk、miRanda、Targetscan等生物信息学软件预测miR-375对AEG-1和JAK2基因的结合位点。（2）构建p MIR-GLO-AEG-1-3’UTR wt/mut和p MIR-GLO-JAK2-3’UTR wt/mut荧光素酶报告载体,通过基因测序验证重组质粒的正确性。（3）通过荧光素酶报告法、Western Blot以及免疫荧光等技术确证miR-375对AEG-1和JAK2基因的靶向关系。3.miR-375调控“H.pylori诱导的胃癌EMT”的机制研究（1）构建miR-375低表达和过表达胃癌细胞模型,利用划痕-修复和Transwell以及免疫荧光等技术分析miR-375与“H.pylori诱导的胃癌EMT”的相关性。（2）根据小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）的相关原则设计JAK2的si RNA,验证所设计的JAK2 si RNA的干扰效率,筛选具有较高干扰效率的JAK2 si RNA;通过JAK2 si RNA靶向沉默JAK2基因的表达,用划痕修复实验、Transwell等实验来检测miR-375是否通过JAK2影响幽门螺旋杆菌诱导的胃癌迁移能力。结果1.H.pylori感染胃黏膜细胞模型中差异性miRNAs和m RNA的筛选（1）对H.pylori感染胃黏膜细胞模型的全转录测序分析发现在H.pylori感染的正常胃黏膜细胞模型中,miRNAs有21个上调表达,11个下调表达;m RNA有3107个上调表达,3156个下调表达;在H.pylori感染的胃癌细胞模型中,miRNAs有41个上调表达,32个下调表达;m RNA有4042个上调表达,2851个下调表达。另外,发现miR-375在H.pylori感染的正常胃黏膜和胃癌细胞模型中均呈现出低表达,而AEG-1和JAK2呈现高表达。（2）RT-PCR、免疫组织化学和免疫组织荧光等技术证实miR-375在临床胃癌组织中表达显著降低,AEG-1和JAK2在临床胃癌组织中表达均显著增高。临床胃癌组织中EMT上皮细胞标志物E-cadherin低表达,相关转录因子Snail1和间质细胞标志物Vimentin均高表达。2.miR-375对AEG-1和JAK2基因的靶向关系（1）通过miRanda、miRWalk、Targetscan等生物信息学软件预测miR-375对AEG-1和JAK2基因的结合位点,发现miR-375理论上可与AEG-1和JAK2基因3’-UTR区中的多个位点结合。（2）通过基因测序证实重组质粒p MIR-GLO-AEG-1-3’UTR wt/mut和p MIR-GLO-JAK2-3’UTR wt/mut无移码等突变,序列完全正确。（3）通过荧光素酶报告法、Western Blot和免疫荧光等技术证实miR-375可靶向结合AEG-1和JAK2基因。3.miR-375调控“H.pylori诱导的胃癌EMT”的机制研究（1）与mimic nc相比,miR-375 mimics可在H.pylori感染的胃癌细胞中显著下调JAK2的表达;与inhibitor nc相比,miR-375 inhibitors可显著上调JAK2的表达。（2）划痕-修复和Transwell等技术证实miR-375可影响胃腺癌细胞系BGC-823的侵袭迁移能力。（3）RT-PCR和Western Blot证实:JAK2 si RNA可有效下调JAK2的蛋白表达;而且JAK2 si RNA+miR-375mimics更能有效地抑制JAK2的蛋白表达。（4）通过划痕修复和Transwell实验证实:胃癌细胞在JAK2 si RNA干扰JAK2表达后迁移和侵袭能力显著降低;而且JAK2 si RNA+miR-375mimics更能有效抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。结论1.在H.pylori感染的胃黏膜细胞模型和临床胃癌组织中,miR-375等miRNAs呈现低表达,而AEG-1和JAK2等基因呈现高表达。2.在胃癌细胞中,miR-375可靶向结合AEG-1和JAK2基因,通过抑制JAK2基因的表达,参与调控H.pylori诱导的胃癌EMT。