[目的]　　 1.建立一种能同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR方法,探讨影响多重PCR扩增的因素。　　 2.将建立的多重方法应用于检测临床儿童呼吸道标本,对多重方法进行评价,使多重方法能够直接从临床标本中检测与鉴别相应的呼吸道病毒。　　 3.了解临床儿童呼吸道病毒感染常见病原体分布情况,采取有针对性治疗措施,避免盲目用药。对深圳、粤东地区儿童常见呼吸道病毒感染进行监测、分析,并探讨其流行规律。　　 [方法]　　 1标本采集与处理　　 依据病情状况和临床表现采用不同的检测标本,对以上呼吸道症状为主要表现的患者,选鼻咽分泌物为检测标本;对以下呼吸道症状为主要表现的患者,首选支气管肺泡灌洗标本,考虑到进行支气管镜操作具有一定制约因素,选择痰标本进行病原学检测。　　 2引物设计　　 通过查阅文献,在GeneBank中分别找到呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytial virus,RSV)、鼻病毒(Rhinovirus,RHV)、流感病毒A型(Influenza virus A,IVA)、流感病毒B型(Influenza virus B,IVB)、副流感病毒1型(Parainfluenza virus1,PIV1)、副流感病毒3型(Parainfluenza Virus3,PIV3)、偏肺病毒(Metapneumovirus,MPV)、腺病毒(Adenovirus,ADV)和博卡病毒(Bocavirus,BOV)9种呼吸道病毒对应的特异基因序列,分析病毒基因组保守区,根据保守区基因序列利用Primer5.0和Olig06.0软件设计、评价引物。　　 3多重PCR方法检测儿童呼吸道常见病毒　　 优化反应体系,建立检测DNA呼吸病毒和RNA呼吸病毒多重PCR筛查体系。阳性产物用测序引物二次扩增,经测序予以确证。　　 4统计学分析　　 应用统计软件SPSS13.0对计数资料进行卡方检验(X2 test),P＜0.05为差异有统计学意义。　　 [结果]　　 1、所设计引物Tm值相近,在同一条件下均获得较好的扩增。扩增片段大小有差异,能够用琼脂糖凝胶电泳的方法区分开来,引物均只对预期的片段进行扩增。　　 2、根据实验设计,我们主要探讨了以下几个影响反应的因素并进行了调整,包括退火温度、缓冲液的浓度、酶、引物的浓度等。通过优化以上条件,各对引物对应的条带可以获得比较均一的扩增。　　 3、在686例标本中病毒阳性362例(52.77％),其中RSV感染占首位,达到31.22%(113/362),其次是RHV为16.85%(61/362),最低是IVB占0.83%(3/362),IVA占14.36%(52/362),PIV1和PIV3分别占7.73%(28/362)和8.29%(30/362),ADV达到9.67%(35/362),而BOV和MPV分别占6.08%(22/362)和4.97%(18/362)。本研究病例中两种以上病毒感染者达9.3%(64/686),以RSV、IVA联合其他病毒感染为主,最多可见5种病毒合并感染。83例健康儿童对照组中,检测出4例RHV和3例RSV,阳性分别为4.82%和3.61%;仅1例PIV3,阳性率为1.20%,其余均为阴性。　　 4、研究发现,RSV、RHV和IVA是重要的致病原。RSV阳性率分别达16.47%,经统计发现年龄之间差异有统计学意义。RHV和IVA阳性率分别达到8.89%和7.58%,统计后发现年龄之间差异均无统计学意义。　　 5、通过实验室检测结果分析,在深圳地区首先检出BOV和MPV。　　 [结论]　　 1实验证明,所建立多重PCR技术检测儿童呼吸道标本中常见病毒的方法,敏感性、特异性和可重复性好,为常见呼吸道病毒的检测提供了一种方便易行的方法。　　 2 RSV、RHV及IVA是深圳、粤东地区儿童呼吸道感染的主要病毒病原,混合感染以RSV、IVA联合其他病毒感染为主,诊治时应根据所感染病原体制定有针对性的措施。