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本文主要研究了绿藻的基因工程,主要内容包括绿藻的无菌纯化、八氢番茄红素合成酶基因的克隆、绿藻外源八氢番茄红素合成酶基因转化体系的建立和阳性转化子的筛选四部分。本文主要以杜氏盐藻细胞和雨生红球藻细胞作为研究对象。
目前对于利用基因工程手段将外源基因转入到微藻中的实验已经有所报道,通过对藻类基因工程的研究,不仅可以从改造的藻体中筛选出抗性强且生长快的优良藻种,并把藻类作为新型的生物反应器生产某种特殊的有用物质；而且还可以从藻类中分离、克隆有重要经济价值的基因,作为农作物改良的目的基因或用于微生物发酵生产。另外,近年来利用藻类为宿主的基因产物的生产也日益受到关注。因此藻类生物技术,尤其是微藻生物技术将成为人类21世纪微生物技术发展的重要方向。
阿特拉津(Atrazine)是一种除草剂,通过抑制光合作用使杂草死亡,一定浓度的阿特拉津可将杜氏盐藻细胞和雨生红球藻细胞致死。由于杜氏盐藻和雨生红球藻对潮霉素不敏感,而pCAMBIA1301质粒上的抗性为hygromycin基因抗性。因此可以把pCAMBIA1301质粒上的hygromycin基因替换成atzA基因。因此,atzA基因可作为一种筛选标记基因用于阳性转化子的筛选。
主要研究内容及结果如下:
1.首先对藻种进行纯化,结合低速重复洗涤法、连续传代法、加入少量氯霉素的方法,得到较纯净的液体盐藻细胞。然后将纯化后的液体培养物在1％琼脂盐藻固体培养板上培养,再将单藻落挑取、液体培养,从而得到纯净的藻种。
2.提取番茄、辣椒、拟南芥和盐藻的RNA,通过反转录的方法得到cDNA,根据GenBank公布的EF534740设计番茄引物对psy-lc-F/psy-le-R;根据GenBank公布的X68017设计辣椒的引物对psy-lc-F/psy-ca-R；根据GenBank公布的NM121729设计拟南芥引物对psy-at-F/psy-at-R,分别从番茄、辣椒、拟南芥中克隆出八氢番茄红素合成酶(psy)基因。
3.提取盐藻的基因组,根据GenBank公布的M77506设计引物cbr-p-F/cbr-p-R从中克隆出cbr基因。
4.用引物atzA-7/atzA-8从pMD-4质粒中克隆出atzA基因。使用Xhol切掉pCAMBIA1301质粒上的hygromycin基因片段,去磷酸化；对atzA同样用XhoI进行酶切,然后与去磷酸化的pCAMBIA1301载体连接成一个完整的载体。使用BsrBI对cbr-psy-T酶切,回收cbr-psy片段,然后将cbr-psy基因片段插入到atzA-1301质粒中去,通过检测筛选出正向阳性质粒。
5.使用电击转化法或者农杆菌侵染法将构建好的质粒载体转化入绿藻细胞,然后进行阳性转化子的检测。使用6 kV/cm,1×高盐HEPES电击缓冲液,番茄X46的质粒对杜氏盐藻细胞进行电转化已长出单藻落。使用6kV/cm,1×高盐HEPES电击缓冲液,pGreen0029-atAz的质粒对红球藻进行电转化已长出单藻落。
6.挑取固体板上的单藻落进行液体培养,对其中的阳性转化子进行鉴定。