哺乳动物胚胎干细胞是一类由早期囊胚的内细胞团经体外分化抑制培养后获得的具有多能性的未分化细胞。家畜胚胎干细胞技术在家畜动物基因组精准编辑及人类疾病模型建立等方面意义重大,但建系的难度大。近年来研究表明,与信号传导通路相关的小分子化合物以及表观调节作用酶相关抑制物等的使用对胚胎干细胞多能性的维持具有作用。本研究探讨了糖原合成激酶GSK-3β抑制剂CHIR99021、促分裂原活化蛋白激酶MEK抑制剂PD0325901以及DNA甲基化转移酶抑制剂5-AzaC对牛早期胚胎发育的影响及对牛类胚胎干细胞多能性维持的作用。1.药物处理对体外受精胚胎囊胚质量和细胞多能性的影响将体外受精6小时后的胚胎移入SOF发育培养液培养,并分别在培养0小时（Day 0,D0）或48小时后（Day 2,D2）添加2i（CHIR99021+PD0325901）及3i（CHIR99021+PD0325901+5-AzaC）处理,待培养至囊胚期后,利用qPCR检测谱系分化基因和多能相关基因的表达。结果显示,与对照组（DMSO处理）相比,D0期2i处理后卵裂率明显提高;D0期2i和3i处理后囊胚率显著提高,但二者间无差异,囊胚ICM和TE细胞数也无差异;D2期2i、3i处理组与对照组相比,囊胚率均无显著差异。基因表达检测结果表明,D0期2i和3i处理后的囊胚NANOG和FGF4的表达显著提高,SOX17、GATA6、LIN28和LIFR的表达显著降低。另外,2i处理可显著提高FGFR2的表达,3i处理可显著提高PRDM14和c-MYC的表达并显著降低ELF5的表达;D2期2i和3i处理后的囊胚OCT4、NANOG和FGF4的表达显著提高,SOX17、c-MYC和FGFR2的表达显著降低。另外,2i处理可显著降低CDX2、LIN28和LIFR的表达,3i处理可显著提高GATA6和PRDM14的表达且显著降低ELF5的表达。免疫荧光染色结果显示,D0期2i和3i处理组与对照组（DMSO培养组和SOF培养组）囊胚的OCT4、SOX2和CDX2均为阳性。以上结果表明,受精后2i和3i的作用可显著增加胚胎细胞多能性基因的表达。2.药物处理对牛胚胎干细胞建系及其多能性的影响为筛选合适的牛胚胎干细胞培养体系,本研究利用mTeSR（MT）、N2B27或α-MEM为基础培养液,分别添加LIF、CHIR99021、5-AzaC、2i或3i对不同处理后获得的囊胚进行胚胎干细胞分离培养,并比较了不同培养条件下细胞的最高传代次数、多能基因表达水平及体外分化能力。结果表明:1)不同培养条件获得的牛早期胚胎对胚胎干细胞建系的影响分别采用D0期2i和3i培养获得的囊胚,使用未添加小分子化合物以及表观调节作用酶相关抑制物的基础干细胞培养液mTeSR1进行培养,两种胚胎均可获得扁平状（Flat）原代克隆细胞,且获得的bESLCs原代克隆形成率显著高于DMSO对照组。2i组囊胚除可获得扁平状态类胚胎干细胞外,还可获得小型立体状和大型立体状形态的类胚胎干细胞,三种不同形态的类胚胎干细胞碱性磷酸酶均呈阳性。免疫荧光染色结果显示Flat和LDS状态的细胞均表达OCT4、NANOG、SOX2及表面标志因子TRA-1-60和TRA-1-81。基因表达检测表明,2i组来源的LDS状态的细胞高表达甲基化转移酶基因DNMT3a、DNMT3b、DNMT1及Primed特异标志CDH2和OTX2,而Flat状态的细胞高表达Naive ESC特异标志REX-1、KLF4、TFE3和CDH1。体外分化能力检测显示,3i组囊胚获得的第9代bESLCs可形成类胚体（EB）,但不表达内胚层特异基因ALBUMIN。2)干细胞基础培养液的不同对干细胞建系的影响以MT为基础培养液分别添加5-AzaC、2i、3i进行囊胚接种及干细胞培养,其结果优于以N2B27为基础培养液分别添加2i和CHIR+LIF以及以α-MEM为基础培养液分别添加3i+LIF和5-AzaC+LIF等的处理组。MT基础培养液处理组的细胞可传至8-17代,而后二种基础培养液处理组中细胞传代培养均不超过4代。基因表达检测结果显示,3i+LIF处理组获得的原代细胞均表达OCT4、NANOG和SOX2基因,而CDX2、PRDM14和STAT3低表达;3)mTeSR1中小分子化合物的添加对胚胎干细胞建系的影响采用经未添加小分子化合物以及表观调节作用酶相关抑制物的基础发育培养液SOF中培养获得的囊胚,经5AMT、2iMT和3iMT培养后,均可获得扁平状原代克隆细胞,检测第五代bESLCs均拥有正常的核型和60条染色体。5AMT组和3iMT组获得的细胞在贴壁率及传代次数上均高于MT组和2iMT组,且3iMT组培养获得的细胞原代克隆形成率显著高于其他组。与D0期2i和3i处理组囊胚经MT基础培养液获得的bESLCs相比,5AMT、2iMT和3iMT培养获得的第五代细胞均表达核心多能基因OCT4、NANOG和SOX2基因,且在3iMT处理组中高表达。免疫荧光染色显示,3iMT组获得的细胞表达OCT4、NANOG、SOX2及表面标志因子TRA-1-60和TRA-1-81。体外分化能力的检测显示,3iMT培养组获得的第9代bESLCs可形成类胚体（EB）,且表达三个胚层的相关基因。综上所述,小分子化合物的使用可以促进体外受精胚胎卵裂率和胚胎发育率的提高,并影响胚胎细胞多能性基因的表达。另外对牛胚胎类干细胞的分离效率、克隆形态、传代次数、多能基因表达水平以及体外分化能力具有作用。