本研究分为二部分：　　 第一部分：大鼠血管纹边缘细胞及螺旋神经节细胞的原代培养及鉴定　　 目的：建立新生大鼠耳蜗血管纹边缘细胞(Marginal cells，MCs)和螺旋神经节细胞(Spiral ganglions，SGNs)的体外培养及纯化体系。　　 方法: 出生0-3天的新生Wistar大鼠断头后解剖显微镜下取出耳蜗侧壁血管纹和含有螺旋神经节的Rosentol管，利用酶消化法制成细胞悬液后接种于细胞培养板，37℃，5[％]CO2/95[％]O2的培养箱中培养。MCs使用加入生长因子的MEM –αI培养液，SGNs使用含有10[％]FBS的DMEM-F12培养液。培养早期采用低浓度血清培养基、差异性贴壁、选择性消化三种方法纯化MCs。细胞接种24小时后采用5umol/L阿糖胞苷纯化SGNs 48小时，改用NB+B27神经细胞专用培养基。纯化后细胞爬片，应用免疫细胞化学及电镜观察、鉴定培养的细胞。　　 结果：MCs接种24h后贴壁生长，后期形成单层“铺路石”样外观，细胞顶端可见分泌小泡，还可见由很多MCs形成的“dome”。采用低浓度血清培养基、差异性贴壁、选择性消化三种方法能去除大部分成纤维细胞。免疫细胞化学检测MCs表达角蛋白-18阳性。SGNs接种24小时候贴壁生长，胞体透明，折光性好，长出小突起。纯化后SGNs呈典型的双极神经元形态，轴突长度是胞体的3-4倍，后期突起延长，相互交织。加入5umol/L阿糖胞苷纯化48小时能去除大部分非神经细胞。免疫细胞化学检测SGNs表达神经丝-200阳性。　　 结论：新生大鼠利用酶消化法结合低浓度血清培养基、差异性贴壁、选择性消化及加入阿糖胞苷等纯化方法可以在体外培养出纯度较高的MCs和SGNs。为进一步研究MCs和SGNs的生理和病理功能提供良好的实验模型。　　 第二部分：D-gal诱导血管纹Mcs和SGNs衰老模型的建立　　 目的：建立D-gal诱导的血管纹边缘细胞和螺旋神经节细胞的衰老模型。　　 方法：纯化后的MCs和SGNs培养数天，倒置相差显微镜下观察细胞形态，MTT法绘制细胞生长曲线。纯化后细胞分为两组，实验组和对照组。浓度梯度：MCs两组分别给予含有2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml D-gal和D-glu的培养基；SGNs两组分别给予含有2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml D-gal和D-glu的培养基。时间梯度：MCs不同浓度组分别培养24h、48h、72h、96h、120h，SGNs不同浓度组分别培养24h、48h、72h、96h、120h。CCK-8试剂盒检测细胞活性，细胞计数，绘制细胞增殖曲线。流式细胞仪检测细胞周期。巢式PCR法检测衰老细胞线粒体DNA4834bp缺失情况。荧光定量PCR方法检测不同浓度和作用时间两种衰老细胞线粒体DNA4834bp缺失突变率的改变。Β-半乳糖苷酶染色，检测衰老。　　 结果：纯化后MCs在培养第九天达到增殖高峰，之后开始出现细胞凋亡和坏死。SGNs不能增殖，在纯化后第5天开始出现细胞凋亡和坏死。CCK-8试剂盒检测MCs 8mg/ml、10mg/ml组培养96h实验组细胞活性明显低于对照组。8mg/ml组培养96h、120h实验组细胞活性明显低于对照组。SGNs 6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml组培养72h后实验组细胞活性明显低于对照组。6mg/ml组培养72h、96h、120h实验组细胞活性明显低于对照组。衰老细胞存在细胞周期阻滞，S、G2-M期减少，G0-G1期增多。巢式PCR法检测到衰老细胞存在线粒体DNA4834缺失。荧光定量PCR检测显示，8mg/ml D-gal或D-glu作用于MCs，随着时间的延长，4834bp突变率逐渐变大，96h达到高峰。不同浓度D-gal和D-glu作用MCs96h，中等浓度组(8mg/ml)4834确实突变率达高峰。SGNs 6mg/ml D-gal或D-glu作用72h后4834缺失突变率达高峰。不同浓度D-gal和D-glu作用SGNs72h后，6mg/ml组达到最高突变率。两种衰老细胞半乳糖苷酶染色为蓝色，阳性表现。　　 结论：D-gal能够抑制MCs和SGNs的生长发育和分裂繁殖，加速细胞老化。D-gal作用于MCs和SGNs后引起的衰老细胞出现线粒体DNA4834大片段缺失。随着药物浓度的升高和作用时间的延长，缺失突变率达到最高峰。