论文部分内容阅读
蛇毒是由毒腺分泌的含有多种有毒组分的混合物。其中许多组分为具有生物活性的蛋白,因而能帮助毒蛇捕杀和辅助消化猎物。蛇毒组成和含量差异一直以来备受研究者的关注。随着蛋白质组学技术的成熟,蛇毒蛋白质组学研究得到快速发展。迄今为止,国际上对蝰蛇科种类的蛇毒蛋白质组研究较多,对眼镜蛇科种类的蛇毒蛋白质组研究较少。本研究包括两部分内容：第一部分以短尾蝮(Gloydius b revicaudus)和舟山眼镜蛇(Naja atra)蛇毒为研究对象,通过反向高效液相色谱、一向垂直电泳、基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)或碰撞诱导解离串联质谱(CID-MS/MS)技术相结合来鉴定蛇毒组成和含量,同时对两种蛇毒的酶活性进行分析；第二部分以短尾蝮、眼镜蛇、五步蛇(Deinagkistrodon acutus)和银环蛇(Bungarus multicinctus)四种蛇毒为研究对象,研究这四种蛇毒与商业用抗蛇毒血清之间的免疫反应,筛选获得每种蛇毒的特异性抗体,进一步构建鉴定这四种蛇毒的ELISA检测方法。主要研究结果和结论如下：1.短尾蝮和舟山眼镜蛇蛇毒组鉴定及活性分析在反相液相分离条件下,短尾蝮蛇毒和舟山眼镜蛇蛇毒,能够被明显地分离开。在短尾蝮蛇毒中,反相液相共分离获得27个检测峰。在舟山眼镜蛇蛇毒中,反相液相共分离获19个检测峰。两种蛇毒中的大多数组分能被MALDI-TOF-TOF鉴定,短尾蝮蛇毒中的少量组分需要通过CID-MS/MS进行鉴定。结果显示,短尾蝮蛇毒含有9个毒素蛋白家族,分别为PⅡ和PⅢ型蛇毒金属蛋白酶、D49型磷脂酶A2、去整合素、丝氨酸蛋白酶、L氨基酸氧化酶、C型类凝集素、半胱氨酸富集蛋白和5’核苷酸酶。短尾蝮蛇毒主要组分为蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶A2,两者分别占总毒素蛋白含量的64.5%和25%。而舟山眼镜蛇蛇毒含有4个毒素蛋白家族,分别为三指毒素、D49型磷脂酶A2、半胱氨酸富集蛋白和PHⅢ型蛇毒金属蛋白酶。舟山眼镜蛇蛇毒主要组分为三指毒素和磷脂酶A2,两者分别占总毒素蛋白含量的83.1%和13.1%。短尾蝮蛇毒具有明显的酪蛋白水解活性,是舟山眼镜蛇蛇毒的14倍。舟山眼镜蛇蛇毒的5’核苷酸酶活性是短尾蝮蛇毒的27.5倍。两种蛇毒的碱性单磷脂酶活性也表现出显著差异,短尾蝮蛇毒活性仅为舟山眼镜蛇蛇毒的四分之一。此外,短尾蝮蛇毒的磷脂酶A2活性和L氨基酸氧化酶活性要超出舟山眼镜蛇蛇毒0.5倍。丝氨酸水解活性和纤维蛋白活性仅在短尾蝮蛇毒中发现。乙酰胆碱酯酶活性仅在舟山眼镜蛇蛇毒中发现。2.四种蛇毒特异性抗体制备及蛇毒鉴定通过ELISA技术检测四种蛇毒与抗蛇毒血清间的免疫反应,结果显示所有检测中蛇毒与抗蛇毒血清反应都呈现阳性。当抗蛇毒血清浓度升高时,交叉反应现象更加明显。但蛇毒与同种抗蛇毒血清间的反应比与异种抗蛇毒血清间的反应更为强烈。同时,采用蛋白印迹法检测四种蛇毒与抗蛇毒血清间的免疫反应,结果显示蛋白印迹中条带特征与一向垂直电泳中条带特征相对应。蛋白印迹结果表明抗蛇毒血清与相应蛇毒免疫反应强。主要反应区域分别为Bm低分子量区(-14-35kDa)、Na中分子量条带(～45-66kDa)和低分子量条带(～14-25kDa)、Da中分子量和高分子量条带(～45-115kDa),几乎所有Gb条带均有免疫原性。蛇毒组分的免疫原性与其丰富度有关,未发现分子大小与免疫反应强度有关。在所有抗蛇毒血清与蛇毒反应中,抗蛇毒血清对相应蛇毒呈现最大的中和作用,抗蛇毒血清对同科蛇毒的中和作用高于其对非同科蛇毒的中和作用。通过ELISA和蛋白印迹技术检测特异性抗体的专一性。结果表明在不同浓度下,四种特异性抗体均具有专一性。蛇毒鉴定结果表明完成整个蛇毒鉴定实验需35分钟左右。在鉴定Na蛇毒实验中,阳性对照孔和阳性样品孔的OD值分别为0.5、0.4,为其他三种蛇毒阳性值的1/2-2/3。四个阳性样品孔OD值均远高于其对应的临界值(0.12、0.09、0.08和0.08)。