论文部分内容阅读
目的:以micro RNA-150(mi R-150)为活性药物成分(API),以组氨酸-赖氨酸聚合物(Histidine-Lysine Polymer,HKP)作为体内导入载体,研究与开发微核酸-多肽注射药物用于大肠癌的特异性靶向治疗。方法:(1)配体靶向型载体与微核酸混合试剂的制备采用1%的琼脂糖作为凝胶电泳支持物,通过琼脂糖凝胶电泳,定性观察不同质量的HKP对micro RNA的包载能力,初步确定HKP与micro RNA的质量比。通过动态光散射原理,利用激光粒度仪测量不同质量比例的HKP与micro RNA形成纳米复合物的粒径电位,将其作为HKP与micro RNA不同质量比的稳定性参考。应用一种超灵敏的核酸荧光染料Ribo Green定量试剂对HKP与micro RNA形成纳米复合物的包封率进行测定。使用实时荧光定量PCR法对导入混合制剂后的Lo Vo细胞内靶基因m RNA的表达水平进行半定量分析,以检测HKP-mi R-150混合制剂的体外生物学活性。(2)人大肠癌Lo Vo细胞系异体移植瘤模型建立及HKP-mi R-150混合制剂药效学验证4周龄BALB/c裸鼠在无特殊病原菌(Specific pathogens free,SPF)环境下经1周的环境适应期后,取对数生长期的人大肠癌细胞系Lo Vo细胞用于皮下移植,每只裸鼠皮下接种5×106个细胞,约7天后成瘤并将裸鼠随机分成6组。将经HKP包载的mi R-150及其它控制组的微核酸药物制剂注射入肿瘤组织,每两天注射一次药物,连续治疗9次,整个过程共计18天。随时观察并记录裸鼠皮下移植瘤大小、形状及生长状况。处死裸鼠后分离皮下肿瘤组织,使用荧光定量PCR检测肿瘤组织标本中mi R-150的表达,增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)法检测癌细胞增殖情况及原位TUNEL法检测癌细胞凋亡情况。(3)HKP-mi R-150在体内代谢分布规律及HKP安全性评价研究通过cy-3荧光染料对经HKP包载的mi R-150及未经HKP包载的mi R-150进行定性对比分析,观察HKP-mi R-150混合制剂的在动物体内代谢以及分布情况。通过在小鼠和食蟹猴两个动物种属分别进行急毒和长毒试验,对豚鼠进行皮肤过敏试验,评价HPK试剂的安全性。结果:(1)琼脂糖凝胶电泳显示HKP与mi RNA质量比为4:1时,未能检测到游离micro RNA,确定HKP(API)与micro RNA的质量比在4:1及以上均可满足实验要求。激光粒度仪测量显示,不同质量比例的HKP与micro RNA形成纳米复合物粒径电位数据均较稳定。核酸荧光染料Ribo Green定量试剂对HKP与micro RNA形成纳米复合物的包封率测定结果显示:随着HKP量的增加,游离mi RNA量在降低,即包封效果在递增并且4:1的时候,游离mi RNA量非常低,适合用于实验的进一步展开。通过实时荧光定量PCR法检测HKP-mi RNA纳米复合物在体外对细胞靶基因的表达水平,结果显示HKP与mi RNA质量比4:1合适且有效,可以确定作为制剂配方比例。(2)实验成功建立了裸鼠皮下移植瘤动物模型(36/36)。18天给药结束后,发现除了mi RNA-150治疗组,其它各组都呈现和未治疗控制组相似的生长趋势,而mi RNA-150治疗组的肿瘤生长显著减缓。从第七次治疗开始,肿瘤生长明显被抑制;定量RT-PCR检测肿瘤组织中靶向微核酸表达水平,结果显示HKP-mi R-150治疗组靶向微核酸表达显著高于其它组别;检测经过治疗的肿瘤组织,发现增殖细胞核抗原在HKP-mi R-150 mimics治疗组中,与其它对照组和未治疗有显著差别,经过HKP-mi R-150 mimics药物治疗的肿瘤组织中的PCNA细胞核大量减少,提示肿瘤细胞死亡;使用经典细胞程序化死亡检测的TUNEL法,检测经过治疗的肿瘤组织,HKP-mi R-150 mimics治疗组与其它对照组和未治疗组有显著差别,经过HKP-mi R-150 mimics药物治疗的肿瘤组织中的TUNEL细胞核大量增加,提示治疗诱导肿瘤细胞程序化死亡。(3)cy-3荧光定性分析结果显示:经HKP包载后,mi R-150在动物体内作用时间较未经HKP包载的mi R-150在动物体内作用时间显著延长。腹腔脏器成像结果显示:HKP-mi R-150-Cy-3组小鼠小肠、结直肠、肾脏、脾脏在24h后仍有药物富集。安全性评价结果显示应用HKP包载体的动物均未见明显全身急性毒性和长期反应以及皮肤过敏反应,HKP载体安全剂量大于1080μg/kg。结论:HKP与mi RNA按照4:1质量比进行混合后,游离mi RNA显著减少,可与HKP形成稳定的复合物,同时显著提高了mi RNA在体内的稳定性。动物药效学实验显示该混合制剂通过瘤内注射可诱导肿瘤细胞程序化凋亡,有效抑制肿瘤细胞增长。安全性评价研究结果显示HKP作为多肽聚合物,具有无毒、生物可降解性强的优点,因此,HKP可以作为一种高效低毒的mi RNA药物载体,应用于mi RNA药物的体内运载。本研究中的HKP-mi R-150药物制剂可作为新一代1.1类抗大肠癌候选创新药继续推动向临床试验的方向进行。