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第一部分胶质瘤干细胞具有放疗抵抗特性目的：比较放疗后胶质瘤干细胞与其对应分化细胞的细胞周期,细胞存活与凋亡方法：(1)将人胶质母细胞瘤细胞系U87细胞,U251细胞用不含血清的干细胞培养基培养成具有干细胞特性的细胞U87-sph,U251-sph。将人胶质母细胞瘤干细胞系NCH-421k用分化培养基培养1周诱导分化为NCH-421k-dif。(2)用流式,RT-PCR和免疫荧光鉴定干细胞和分化细胞特征性分子标记物的表达。(3)对U87和U87-sph进行X射线照射,检测两种细胞在不同放射剂量,照射后不同时间点的凋亡率,细胞周期和细胞存活率。U251和U251-sph在X线照射后的凋亡率也同样进行了测定。用Hoechst33342/PI染色检测放疗后U87和U87-sph凋亡坏死情况。结果：(1)U87和U251经过干细胞培养基培养后,表现为成球悬浮生长,NCH-421k用分化培养基诱导分化后呈贴壁生长,细胞形态为梭形。(2)用流式,RT-PCR检测发现U87-sph和U251-sph的干细胞标记物(CD133, nestin, Sox-2)较U87和U251明显上升。NCH-421k-dif的干细胞标记物较诱导分化前明显降低,而分化标记物GFAP明显升高。细胞免疫荧光检测U87-sph的干细胞标记物表达增强。(3) U87-sph不同剂量X射线照射后不同时间点的细胞存活率均较U87高。U87在X射线照射后存在明显的G2/M期阻滞,以12h和24h最为显著；U87-sph在X射线照射后细胞周期变化不明显。U87-sph和U251-sph在X射线照射后的细胞凋亡率明显较其亲本细胞U87和U251降低。Hoechst33342/PI染色显示放疗后U87凋亡坏死增加,U87-sph未见明显的凋亡坏死。结论：胶质母细胞瘤细胞系用无血清干细胞培养基培养可培养出具有干细胞特性的细胞。胶质母细胞瘤干细胞用分化培养基培养1周可诱导分化。胶质瘤干细胞较其分化细胞具有放疗抵抗的特性。第二部分放疗抵抗胶质瘤干细胞株的筛选鉴定和特性研究及TRADD,DR5在放疗抵抗胶质瘤干细胞株中的表达目的：构建放疗抵抗的胶质瘤干细胞株(GSC-R)并初步探讨其放疗抵抗的机制。方法：对胶质瘤干细胞系NCH-421k, NCH-644和本实验室前期建立的U87-sph进行长期剂量递增的X线照射,筛选出存活下来的放疗抵抗的胶质瘤干细胞株NCH-421k-R, NCH-644-R和U87-sph-R。对筛选出的细胞株进行放射生物学的鉴定,绘制生长曲线,存活曲线并计算出放射生物学参数D0,Dq和SF2等。对三种GSC-R及其亲本细胞系的放疗后细胞周期和凋亡率进行了分析。对放疗抵抗胶质瘤干细胞株的干细胞标记物CD133进行了流式测定。对其干细胞标记物和侵袭相关基因MMP-2, MMP-9进行了RT-PCR的检测。对本课题研究的死亡受体分子TRADD, DR5和其他凋亡相关蛋白进行了RT-PCR和western blot检测。结果：NCH-421k-R, NCH-644-R和U87-sph-R的D0, Dq和SF2均显著增加。放疗抵抗的胶质瘤干细胞株放疗后G2/M期阻滞明显减少,放疗后凋亡率降低。NCH-644-R和U87-sph-R与其亲本胶质瘤干细胞系比较,倍增时间明显缩短,NCH-421k-R无显著差异。三种GSC-R与亲本GSC比较,CD133的表达比例明显增加。RT-PCR表明GSC-R的干细胞标记物表达增加,侵袭性相关指标MMP-2,MMP-9表达也增加。死亡受体分子TRADD,DR5和抑制凋亡蛋白cFLIP在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加,而死亡受体DR4和凋亡相关蛋白Bcl-2在三种GSC-R中表达水平变化具有异质性。结论：构建成功三种更具有放疗抵抗特性的胶质瘤干细胞株。GSC-R的干细胞特性增强,TRADD,DR5的表达增加。第三部分TNFR1/TRADD/NF-κB通路与TRAIL/DR5通路在胶质瘤干细胞放疗增敏中的作用及其机制目的：探讨TNFR1/TRADD/NF-κB通路与TRAIL/DR5通路在胶质瘤干细胞放疗增敏中的作用及其放疗增敏的作用机制。方法：利用PCR apoptosis array对放疗后U87和U87-sph的凋亡相关mRNA水平表达变化进行测定。通过REMBRANDT数据库查找TRADD基因在胶质瘤中表达情况及其和预后的关系。Western blot测定正常组织和GBM组织中TRADD的表达。通过RT-PCR和Western blot测定胶质瘤干细胞和对应分化细胞中TRADD和DR5的表达。通过western blot检测单次8Gy剂量照射后不同时间点U87和U87-sph的死亡受体相关蛋白,凋亡相关蛋白及NF-κB通路相关蛋白的表达情况。检测加入不同浓度的NF-κB抑制剂PDTC后,U87和U87-sph的凋亡率变化。比较单纯放疗,单纯PDTC和PDTC联合放疗对U87和U87-sph的凋亡的影响,并用Western blot检测三种处理方式后U87-sph和U251-sph凋亡蛋白和NF-κB通路蛋白表达水平变化。检测加入不同浓度的TRAIL后,U87和U87-sph的凋亡率变化,并用Western blot检测不同浓度TRAIL处理后U87和U87sph凋亡蛋白和NF-κB通路蛋白表达水平变化。比较单纯放疗,单纯TRAIL和TRAIL联合放疗对U87和U87-sph凋亡的影响,并用Western blot检测三种处理方式后U87-sph和U251-sph凋亡蛋白和NF-κB通路蛋白表达水平变化。结果：通过PCR apoptosis array发现放疗后U87-sph TRADD与DR5mRNA水平较未处理U87-sph增加较明显,而在U87中未发现这种变化。REMBRANDT数据库查找TRADD基因在胶质瘤尤其在GBM中表达明显增加。TRADD过表达病人的生存期明显较短。通过Western blot验证了GBM组织中TRADD表达增高。干细胞中TRADD在mRNA水平和蛋白水平均较分化细胞表达增加,而DR5趋势相反。在单次8Gy剂量照射后,U87-sph中TNFR1,TRADD和DR5表达均较分化细胞增加明显。U87-sph放疗后NF-κB通路活化明显较分化细胞强。随着浓度递增,U87-sph对TRAIL诱导凋亡敏感性较U87差。而U87-sph和U87对PDTC诱导的凋亡敏感性差异不大。Western blot发现U87-sph在加入TRAIL后NF-κB通路明显激活,而U87未见这种变化。PDTC联合放疗,TRAIL联合放疗均能明显增加胶质瘤干细胞U87-sph的凋亡率。Western blot结果显示PDTC联合放疗后胶质瘤干细胞中NF-κB通路明显被抑制；TRAIL联合放疗后DR5上调,cFLIP表达下降,而p-NF-K B的表达仍然增加。结论：TNFR1/TRADD/NF-κB通路在胶质瘤干细胞放疗抵抗中发挥重要作用。通过TRAIL和NF-κB抑制剂PDTC均能明显增加胶质瘤干细胞对放疗的敏感性。其中PDTC通过抑制NF-κB通路发挥作用,而TRAIL联合放疗增加放疗敏感性的机制可能为上调DR5,下调cFLIP的表达。