论文部分内容阅读
研究背景:小胶质细胞（microglia,MG）是中枢神经系统（central nervous system,CNS）内的固有免疫细胞。MG是CNS稳态的保护者,也是应对CNS微环境改变最早发生反应的细胞,能够迅速进入活化状态。活化的MG存在两种功能和形态截然不同的极化类型,即促炎的M1型和抑炎的M2型。“经典活化的”M1型MG通过分泌针对病原体和肿瘤细胞的促炎性细胞因子参与宿主防御过程,同时会造成组织和细胞的损伤;“替代活化的”M2型MG通过释放抗炎性细胞因子减轻炎症反应,并可通过产生修复相关因子参与损伤修复过程。正常情况下两种极化类型之间存在着动态平衡,因此调控病理状态下的MG极化状态在控制CNS神经炎症方面十分重要。组织蛋白酶C（Cathepsin C,CatC）,又称二肽肽酶I（dipeptidase I,DPPI）是属于番木瓜超家族的半胱氨酸蛋白酶,具有二肽肽酶活性,可通过活化丝氨酸蛋白酶,组织蛋白酶G和蛋白酶3等参与外周炎症反应。同时,CatC在CNS表达及参与神经炎症性疾病也被逐步证实。我们在前期研究中发现,在LPS腹腔注射和促炎性因子诱导的神经炎症模型中,CatC高表达于活化的MG,并可以被分泌至细胞外,而且具有酶活性。随后利用野生型、条件性CatC过表达和CatC敲减小鼠制备LPS诱导的神经炎症模型,发现CatC过表达加重神经炎症,而这一作用是通过促进MG向M1极化实现的。但是,CatC诱导MG向M1型极化的分子机制和相关信号转导系统尚不清楚。研究目的:本文旨在阐明CatC促进MG向M1型极化的相关分子机制。这不仅可以进一步了解CatC的基因功能,并且为CNS神经炎症的治疗提供新的靶点。研究方法:在本研究中,我们使用原代培养的MG,外源性给予CatC活性单体刺激,采用全基因表达谱微阵列分析的技术,筛选和分析相关差异表达的基因。从中选取NMDA受体亚基NR2B作为主要分子,采用q RT-PCR、流式细胞术和Western blot等技术探究分析了NR2B表达、NR2B介导的胞浆内钙离子浓度改变以及钙依赖的PKC/p38 MAPK/NF-κB信号转导通路的激活情况。实验结果以Mean±SEM表示,实验数据采用t检验进行统计分析。p≤0.05为统计学意义的判定标准。结果:1.全基因组微阵列分析结果显示,与未处理的原代培养的MG相比,CatC刺激的原代培养的MG内2组样本中有254个差异表达基因,其中包括103个上调基因和151个下调基因。从中筛选出包括Grin2b在内的6个基因进一步进行q RT-PCR检测,结果均显示表达上调,并将Grin2b作为深入研究的分子。2.CatC的刺激增加了原代培养的MG和BV2细胞NR2B的m RNA和蛋白表达水平及其磷酸化水平;且在使用组织蛋白酶抑制剂E-64共刺激后,NR2B的表达水平降低。3.CatC刺激BV2细胞胞内Ca2+浓度显著增加;与E-64共刺激和使用NMDA抑制剂MK-801预处理后,BV2细胞内的Ca2+水平均有一定程度的降低。4.CatC刺激原代培养的MG和BV2细胞内PKC的磷酸化水平增高,p-PKC/tPKC的比值显著增高;给与E-64共刺激和MK-801预处理后,原代培养的MG和BV2细胞内PKC的磷酸化水平均降低。5.CatC刺激原代培养的MG和BV2细胞后,MAPKs/NF-κB信号通路上关键分子（p38,IκBα,p65）发生磷酸化,且磷酸化/非磷酸化比值显著增高;在给与E-64共刺激和MK-801预处理后,CatC刺激的原代培养的MG和BV2细胞内p38,IκBα,p65的磷酸化水平均降低,且磷酸化/非磷酸化的比值也不同程度的降低。结论:CatC通过诱导MG中NR2B表达上调、胞浆内Ca2+的浓度增高,激活Ca2+依赖的PKC/p38 MAPK/NF-κB信号通路,促进MG向M1型极化。