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目的:间皮素(mesothelin,MSLN)是由单克隆抗体K1在正常间皮细胞以及间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤中识别的抗原。间皮素cDNA长约2138bp,含有1884bp的开放阅读框,编码Mr 69 000多肽。间皮素的前体蛋白由628个氨基酸组成,含有4个糖基化位点,其中的一个或多个位点发生糖基化后,间皮素及被furin蛋白酶水解为Mr分别为40 000和31 000的两个片段,其中40 000的片段通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphtidylinositol)与胞膜相连,称之为间皮素;31 000的片段脱落,称为巨核细胞集落刺激因子(megakaryocyte-potentiating factor,MPF)。间皮素转录结构中的两个次级连接的存在使间皮素基因编码蛋白含有两个异构体,异构体2在翻译过程中保留了第16个和第17个外显子中间的内含子,造成翻译过程中的框移突变,蛋白翻译提前中止,使其从细胞表面脱落形成可溶性间皮素相关蛋白(soluble mesothelin-related protein,SMR)。SMR是一个Mr为42 000～45 000的NH2末端氨基酸序列,与间皮素的膜连接部分完全相同。SMR可以间皮素阳性肿瘤细胞的培养上清中及间皮素阳性肿瘤患者的腹水、血清中检测到,从而使之有可能成为新的恶性肿瘤监测指标。但到目前为止,国内仍无抗SMR的单克隆抗体和进行SMR检测的ELISA试剂盒。基于这一目的,本研究中选择性合成了鼠抗人SMR的多肽制备了单克隆抗体(mAb),并对其生物学特异性进行了鉴定。方法:1应用GOLDKEY软件对从NCBI蛋白质数据库中调出人MSLN氨基酸序列进行分析,对MSLN的Hopp & Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、β-转角等多参数分别进行预测,然后用吴氏法进行综合分析其准确性。2抗SMR抗体的制备应用方法1选取的SMR抗原表位的氨基酸序列,合成多肽抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后,选出抗SMR抗原表位的阳性克隆,再进行亚克隆,将稳定分泌抗SMR抗原表位单克隆抗体的细胞株进行扩大培养。抗体效价用ELISA法检测。取一定量杂交瘤细胞给BALB/c小鼠腹腔注射,约两周后收集腹水,得到高效价抗SMR抗原表位的IgG,应用免疫细胞化学、SDS-PAGE和Western blot分析等方法对抗体进行特异性鉴定。3 mAb的效价、亚类及特异性鉴定3.1效价测定:利用SMR复合肽抗原(1μg/mL)1:1 000稀释包被微孔板,利用ELISA法检测腹水抗体效价。3.2抗体亚类测定:用mAb亚类分型试剂盒,按试剂盒说明书操作。用PH7.2-7.6 PBS稀释鼠抗SMR单克隆抗体,稀释度为1:20 000。取150μl稀释好的SMR单克隆抗体放入试管中,混匀,室温孵育30分钟。试管中插入试剂条反应5分钟,观察结果。3.3特异性鉴定:(1)免疫细胞化学(SP)法检测单克隆抗体与间皮素阳性卵巢癌细胞表面天然蛋白反应性。盖玻片常规浸酸、冲洗、高压灭菌后,放置于无菌6孔培养板中。选择经证实表达间皮素的处于对数生长期的人卵巢癌细胞系OVCAR-3、SKOV3、3AO分别加入各板,制成细胞爬片。3%过氧化氢室温孵育30min,以去除内源性过氧化氢,蒸馏水冲洗,磷酸盐缓冲溶液冲洗5min×3次,10%山羊血清封闭非特异性抗原20min,加入小鼠抗人间皮素抗体2H10或5B2,4℃过夜。磷酸盐缓冲液冲洗5min×3次,加入生物素标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育30 min;加入辣根过氧化物酶标记的链霉素,自来水停染,苏木精复染,中性树胶封片。对照组用PBS代替一抗。(2)Western Blot分析制备的单克隆抗体与间皮素目的蛋白的反应性。从上述卵巢癌细胞中提取总蛋白质后,按考马斯亮蓝试剂盒说明测定蛋白质浓度,取50μg总蛋白质加入等体积(2×)上样缓冲液上样,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,先80V电泳30 min,后转为120 V电泳90 min。根据标准分子量蛋白质来确定待测蛋白质的位置(间皮素为40 000)进行转膜:由正极向负极按滤纸-膜-胶-滤纸的顺序,250mA 4小时,5%脱脂奶粉封闭1小时,加入小鼠抗人间皮素抗体2H10或5B2,4℃过夜。清晨洗膜20 min×3次,加入二抗,反应1小时,最后DAB显色。结果:1通过对MSLN氨基酸序列的B细胞抗原表位的多参数预测,所预测的一些抗原表位数目和所处的肽段位置有一些参数结果不同,但在氨基酸序列的153-162、282-292及471-481这三个肽段几种预测方法的结果完全一致,且接近β-转角处。因此,我们认为此三处氨基酸片段或其附近可能有抗原表位,其中297-600氨基酸序列为可溶性间皮素。根据综合结果最终选取氨基酸残基471-481片断作为SMR的抗原表位,含有11个氨基酸残基,顺序为Q D L D T C D PR Q L。合成了具有4分枝结构的SMR复合肽抗原。2制备的抗SMR单克隆抗体克隆株2H10效价为1:102400(ELISA)。3抗体特异性鉴定: (1)免疫细胞化学SP法检测结果:经市售抗间皮素抗体(5B2)证实,卵巢癌细胞系OVCAR-3、SKOV3、3AO均为间皮素阳性。本试验制备的抗SMR抗体2H10可以与上述3种细胞反应,均在细胞膜上可见明显的棕黄色颗粒沉着。(2) Western blot检测结果:对上述细胞提取总蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析用商售抗间皮素抗体K1和抗体2H10分别染色均在Mr 40 000左右得到单一条带。结论:根据多参数综合预测,筛选出SMR抗原表位氨基酸片段,以此合成的抗原肽免疫小鼠所制备的单克隆抗体可与天然抗原反应,具有高度的特异性。