研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种慢性潜在致死性自身免疫性疾病,临床上主要表现为涉及多器官损伤（如肾脏、皮肤和中枢神经系统）的系统性紊乱。本病好发于育龄女性,男女发病率约为1:9。SLE发病机制尚未明确,一般认为免疫系统异常、遗传因素、激素水平和环境因素等共同引起SLE的发病。狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）以肾小球免疫复合物沉积及随之发生的炎症反应为特征,是SLE发病和死亡的主要原因。肾脏受累的临床表现主要有蛋白尿、血尿、脓尿、管型尿及肾小球滤过功能下降和肾小管功能衰退等。由于SLE目前仍然无法治愈,极大影响了患者的劳动力和生活质量,甚至危及生命,且消耗大量卫生资源,已成为重要的公共卫生问题。T细胞是免疫系统的重要组成部分,它可以调节B细胞反应并且浸润靶向组织导致器官损伤。SLE患者和狼疮样小鼠均表现为Th细胞功能和信号异常,促使自身反应性B细胞产生病理性自身抗体,并在补体的作用下形成免疫复合物,沉积于重要器官,导致器官炎症损伤。辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）是一种能够分泌白细胞介素17（interleukin 17,IL-17）的T细胞亚群。转录因子维甲酸受体相关孤儿受体γt（retinoid related orphan receptorγt,RORγt）是其特异性转录因子,在Th17细胞的分化过程中起重要的调节作用。大量研究表明,Th17细胞能介导炎性反应,在SLE、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）和系统性硬皮病（systemic sclerosis,SSc）等自身免疫性疾病中发挥重要作用。本课题组及其他研究者发现在SLE和狼疮动物模型中Th17细胞和IL-17水平均有升高,并且与SLE疾病活动指数（Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index,SLEDAI）和LN相关。SLE患者和狼疮小鼠肾小球内检测到IL-17沉积。缺乏IL-17的小鼠其生存率大大增加且不容易进展为LN。这些研究表明Th17细胞和IL-17与SLE和LN发病机制密切相关。低氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1）是一种氧敏感性转录因子,帮助机体对低氧环境适应。它是由HIF-1α亚基和HIF-1β亚基构成的异源二聚体。HIF-1α是HIF-1的功能性亚基,机体对低氧的反应主要依赖于HIF-1α亚基。HIF-1α是细胞代谢调控路径的重要组成部分,在调节免疫细胞效应因子功能和炎症过程中扮演重要角色。研究发现HIF-1α可以通过直接作用于Th17细胞的特异性转录因子RORγt从而促进Th17细胞分化以及IL-17的产生,缺乏HIF-1α可以减低Th17细胞分化。为探讨SLE中HIF-1α与Th17细胞和IL-17的相关性,本课题组前期检测了SLE患者血清HIF-1α和IL-17水平,发现两者显著正相关;利用RNA干扰技术体外沉默SLE患者PBMC中HIF-1α后,发现培养上清IL-17浓度显著下降,HIF-1α与IL-17水平正相关。以上研究提示,HIF-1α可以促进Th17细胞分化及IL-17产生,阻断HIF-1α也许可以作为SLE等Th17细胞相关自身免疫性炎性疾病的治疗方法。关于HIF-1α和SLE的关联也有研究者报道。有研究人员发现LN患者尿HIF-1α水平高于健康对照,且HIF-1α与组织慢性指数和肾小球滤过率相关。与对照相比,在LN肾小球和肾小管均检出更多的HIF-1α⁺T细胞。另有研究报道在狼疮样小鼠CD4⁺T细胞中发现HIF-1α表达升高。本课题组前期研究发现HIF1A基因多态性与SLE之间并无直接关联。迄今为止,HIF-1α在SLE中的作用还没有研究报道过。基于以上研究,我们得出假设——HIF-1α表达和功能的异常可能通过促进Th17细胞和IL-17而间接参与SLE的疾病过程。为验证我们的假设,首先我们延续课题组前期的研究结果,在mRNA水平检测SLE患者中HIF-1α水平并分析其与Th17细胞和SLE的相关性。随后我们选用MRL/lpr狼疮小鼠模型,利用RNA干扰技术在其体内沉默HIF-1α,观察下调HIF-1α是否影响SLE进展以及相关的炎性通路。本研究分为如下三个部分:研究一 HIF-1αmRNA水平与SLE的关联研究目的 检测SLE患者PBMC中HIF-1αmRNA和RORc mRNA水平,分析HIF-1α与Th17细胞特异性转录因子RORc的相关性,探讨HIF-1α与SLE患者临床特征和实验室指标的关联。方法 收集57例SLE患者和38例健康对照,获得知情同意后,抽取非抗凝外周静脉血3⁵ ml,提取PBMC,采用qRT-PCR法检测PBMC中HIF-1αmRNA和RORc mRNA水平,并分析两者相关性;采用自行设计的调查问卷收集调查对象的临床表现和实验室指标,分析HIF-1α与SLE患者临床特征和实验室指标的关联。qRT-PCR数据处理采用ΔΔCt法。采用Excel 2007软件进行数据录入,使用SPSS10.01软件进行数据处理与统计分析,GraphPad Prism 5.0软件作统计图。对不符合正态分布的资料用四分位数间距M（P25,P75）来表示,两组定量资料间的比较采用Mann-Whitney秩和检验,相关性分析采用Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05。结果 （1）SLE患者PBMC中HIF-1αmRNA水平高于HC组,差异具有统计学意义（P<0.001）;（2）SLE患者HIF-1α与RORc正相关,r_s=0.432,P<0.001;（3）临床特征和实验室指标分析结果显示,HIF-1α与SLE关键特异性临床特征和实验室指标如皮疹、关节炎、自身抗体、补体、蛋白尿、神经系统异常、血液异常等均无关联。（4）HIF-1α与病程、用药情况均无相关性。研究二 HIF1α-shRNA腺病毒载体构建、验证与筛选目的 构建HIF1α-shRNA腺病毒载体并进行病毒包装,验证干扰效果并筛选出干扰效率最高的HIF1α-shRNA序列进行扩增与纯化,为后续HIF1α-shRNA干扰MRL/lpr小鼠实验提供无毒且有效的RNA干扰注射药物。方法 设计三条HIF-1α干扰序列,利用pHBAd-U6-GFP干扰载体构建HIF1α-shRNA腺病毒载体。对HIF1α-shRNA腺病毒载体进行包装,得到滴度为10¹00 PFU/ml的重组腺病毒。将HIF1α-shRNA重组腺病毒感染RAW264.7细胞,qRT-PCR检测RAW264.7细胞HIF-1α干扰效率,从三条序列中筛选出干扰效率最高的Ad-HIF1α-shRNA进行大量扩增与纯化,得到滴度为10¹11 PFU/ml的纯化病毒。结果 （1）测序结果显示,小鼠HIF1α-shRNA腺病毒载体质粒中的序列分别与设计的3条HIF1α-shRNA序列一致,表明HIF1α-shRNA腺病毒载体穿梭质粒构建成功;（2）qPCR结果表明,HIF1α-shRNA-1、HIF1α-shRNA-2和HIF1α-shRNA-3腺病毒感染RAW 264.7细胞后,HIF-1α相对表达量较对照分别下降50%、47%和57%,表明三条序列均干扰有效。HIF1α-shRNA-3干扰效果最佳,干扰效率为57%;（3）将干扰效果最佳的HIF1α-shRNA-3腺病毒及对照腺病毒大量扩增与纯化后,感染性滴度测定结果为:Ad-HIF1α-shRNA-3:1.99×10¹¹PFU/ml;Ad-Control-shRNA:1.26×10¹¹PFU/ml。研究三 HIF1α-shRNA对MRL/lpr小鼠疾病进展的作用研究目的 利用RNA干扰技术将腺病毒包装的HIF1α-shRNA导入MRL/lpr狼疮小鼠体内,观察沉默小鼠体内HIF-1α后Th17细胞及其效应因子IL-17变化,以及狼疮病情是否改善。方法 67只雌性MRL/lpr小鼠随机分为3组:HIF1α-shRNA注射组25只、Control-shRNA注射组21只及PBS注射组21只。HIF1α-shRNA注射组小鼠尾静脉注射腺病毒颗粒,阻断小鼠体内HIF-1α的表达,Control-shRNA注射组小鼠尾静脉注射空载腺病毒颗粒,PBS注射组小鼠尾静脉注射等体积PBS。每周注射一次,维持2周。于最后一次干扰后24h、2w、4w三个时点,每个时间点每组各处死6⁹只:（1）观察小鼠的一般特征（活动度、毛发、皮肤等）,称量体重;（2）取小鼠脾脏称重,计算脾脏指数;（3）qRT-PCR检测脾脏淋巴细胞HIF-1αmRNA水平;（4）流式细胞术检测脾脏淋巴细胞HIF-1α蛋白水平、Th17细胞比例;（5）ELISA检测外周血血清HIF-1α、anti-dsDNA抗体、ANA水平;（6）ELISA检测外周血血清Th17相关细胞因子IL-17水平;（7）考马斯亮蓝法检测尿蛋白浓度水平;（8）H&E和PAS染色法检测肾脏组织病理损伤;（9）免疫组化法检测肾脏IgG、C3沉积。结果 （1）与Control-shRNA组、PBS组相比,HIF1α-shRNA组脾脏淋巴细胞HIF-1αmRNA水平在干扰后24 h相对表达量下降,差异具有统计学意义（P=0.025）,2 w和4 w时差异不显著;（2）2 w时,HIF1α-shRNA组与对照组相比,脾脏HIF-1α⁺淋巴细胞和CD4⁺HIF-1α⁺T细胞占脾脏总淋巴细胞比例均显著下降,均有P<0.01,24 h和4 w各组差异不显著;（3）各时间点下,三组小鼠脾脏Th17细胞占脾脏淋巴细胞百分比均无统计学差异;（4）与对照组相比,HIF1α-shRNA组2 w时血清HIF-1α表达下降,P=0.014,而24 h、4 w时无差异;（5）与对照组相比,干扰后2 w和4 w时HIF1α-shRNA组血清IL-17表达下降,差异具有统计学意义（2 w,P=0.031;4 w,P=0.002）;干扰后24 h时三组IL-17水平无差异;（6）与对照组相比,干扰后4 w时血清ANA下降,差异具有统计学意义（P=0.019）,24 h、2 w时差异无统计学意义;（7）三组小鼠干扰后24 h、2 w血清anti-dsDNA抗体水平无统计学差异;干扰后4 w HIF1α-shRNA组有下降趋势,但差异不显著（P=0.095）;（8）HIF1α-shRNA组干扰后24 h尿蛋白与干扰前相比下降,干扰前后差值与对照组相比,差异有统计学意义（P=0.034）,2 w、4 w时尿蛋白差值差异不显著;（9）与对照组相比,HIF1α-shRNA组三个时间点病理损伤均有所减轻,但仅4 w时达到统计学差异（P=0.010）;（10）与对照组相比,各时间点HIF1α-shRNA组IgG、C3沉积均有下降。结论 三部分的研究结果表明:SLE患者体内HIF-1α显著升高并与Th17细胞正相关,体内沉默HIF-1α可能通过下调IL-17水平从而延缓狼疮小鼠病情的发展。本研究首次在mRNA水平上检验了SLE患者中HIF-1α水平及其与Th17细胞之间的关联性,并首次通过RNA干扰MRL/lpr狼疮鼠模型实验,证明了HIF-1α在SLE疾病进展中的作用。综合三部分的研究,我们认为HIF-1α参与了SLE和LN的疾病进程,这一过程可能是通过影响Th17细胞分泌IL-17来间接实现。阻断HIF-1α也许可以成为SLE一个新的治疗靶点。