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脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一种严重的神经系统疾病,会导致感觉和运动功能障碍。炎症微环境、细胞凋亡和胶质瘢痕等诸多因素导致SCI的治疗极为困难。迄今为止,还没有有效的SCI治疗策略。MicroRNAs（miRNAs）是由约22个核苷酸组成的单链非编码RNA。成熟的miRNAs可以与靶基因的mRNA中的3’非翻译区（3’UTR）互补结合,发挥沉默mRNA和转录后调控的功能。研究发现SCI会引起体内miRNAs表达的变化,表明miRNAs可能在SCI的病理生理学中发挥关键作用。据报道,miR21通过抑制促凋亡蛋白的表达,在SCI中发挥神经保护作用。SCI大鼠的损伤组织中miR124的表达水平降低,暗示其表达可能影响SCI的严重程度。研究发现,提高SCI处细胞中miR124的表达量,可提高神经元的数量,从而对SCI修复有益。因此,miRNAs作为SCI的治疗靶点受到了广泛关注。然而,由于miRNAs稳定性不足,以及难以直接被细胞摄取,严重阻碍了 miRNAs在SCI修复治疗中的应用。因此,开发稳定高效的miRNAs递送方法用于治疗SCI的研究意义重大。外泌体是由细胞分泌的一种细胞外囊泡。外泌体内部包含mRNAs、miRNAs、蛋白质、脂质和代谢物等。外泌体具有低免疫原性、稳定性和高渗透性等优点,因此被认为是miRNAs递送的天然理想载体。然而,外泌体具有易扩散、特异性miRNA的容量低和体内保留时间短等缺点,阻碍了其广泛的应用。因此,应开发创新的策略和方法,使外泌体能滞留在病变部位,充分发挥其递送miRNAs的作用,以促进组织修复和再生。胶原蛋白是细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）的主要成分,具有生物相容性高、可降解、细胞粘附性等特性,被广泛应用于组织创伤修复,比如Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ,Col-Ⅰ）支架可用于填充SCI中形成的空腔并促进神经元分化。胶原蛋白结合域（Collagen binding domain,CBD）源自胶原酶,是一种由7个氨基酸组成的多肽（TKKTLRT）,具有与Col-Ⅰ特异性结合的能力,在组织工程研究中经常用于介导其他分子对胶原生物材料的修饰。最近的一项研究报道了一种新型的双重生物特异性肽（BSP）,它的N端含有一个CBD,C端含有短肽（AHLHNRS）,可同时与外泌体膜上的转铁蛋白受体和Col-Ⅰ支架结合。BSP帮助载有紫杉醇的外泌体连接到Col-Ⅰ支架上,使该胶原支架具有促进神经再生的能力。然而,过量的外源多肽难以从胶原支架中去除,可能存在生物安全性的问题,并且结合效率可能无法满足外泌体在胶原支架中高富集的要求。本研究的目的是利用基因工程手段构建一种新型的功能性Col-Ⅰ生物材料（CBD-Lamp2b-miRNA-外泌体-collagen-Ⅰ,CBD-LP-miRNA-EXO-Col）,该材料可以富集包含了特定miRNAs的外泌体,以用于大鼠横断SCI的组织创伤修复。首先,我们将CBD和外泌体膜蛋白Lamp2b的融合序列构建到慢病毒载体的表达框中,通过病毒转染293T,得到稳定高表达CBD-Lamp2b的293T细胞系（CBD-Lamp2b-293T）,通过RT-PCR、凝胶电泳和Western bolt实验,证明CBD-Lamp2b-293T细胞高表达CBD-Lamp2b融合蛋白,并可分泌含有CBD-Lamp2b 的外泌体（CBD-Lamp2b-exosome,CBD-LP-EXO）。而后,使用脂质体将miR21或者miR124的表达质粒导入到CBD-Lamp2b-293T细胞中,使得miR21或者miR124在CBD-Lamp2b-293T细胞中瞬时过表达,分别分泌载有miR21/miR124 的 CBD-LP-EXO（CBD-LP-miR21-EXO/CBD-LP-miR124-EXO）,通过纳米颗粒跟踪分析、扫描电子显微镜、Western blot和RT-PCR证明外泌体富含特定miRNA,且转基因并不影响外泌体的基本特征。通过双荧光素酶报告、免疫细胞化学和Western blot等实验证实了 CBD-LP-miR21-EXO可将miR21递送到细胞中,通过抑制PDCD4/FASLG的表达,抑制PC12细胞凋亡,CBD-LP-miR124-EXO通过递送miR124抑制细胞中PTBP1表达,促进神经干细胞分化为神经元。最后,我们将CBD-LP-miR21-EXOs结合到Col-Ⅰ支架,制备了功能性Col-Ⅰ生物支架（CBD-LP-miRNA-EXO-Col）,并用于大鼠SCI修复。IF、TUNEL、荧光原位杂交技术（FISH）等实验证明CBD-LP-miR21-EXO-Col支架通过延长外泌体在支架中的保留时间实现了含有特定miRNAs外泌体的缓释,实现抑制细胞凋亡,减少胶质瘢痕的产生和促进神经元的存活,最终促进了大鼠SCI的修复。综上,我们的研究开发了一种新型的CBD-LP-miRNA-EXO-Col功能性生物材料,该材料可通过对基因工程改造的外泌体的吸附,实现了对含有特定miRNAs的外泌体的缓释,从而促进了 SCI修复。