伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）是伪狂犬病的病原体,属于疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科。猪是该病毒的主要天然宿主,该病毒给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失,自2011年末以来伪狂犬病毒变异毒株的出现给我国PRV的防控提出了新的挑战。PRV的基因组为双链DNA,其长度大约145 kb左右。该病毒基因组的一个重要特点是GC碱基含量高,可达70～80%。富含鸟嘌呤碱基（G）的DNA或RNA序列能够形成不同于经典双螺旋结构的核酸二级结构:G-四链体结构。形成G-四链体结构的序列普遍存在原核生物和真核生物的基因组上,并且参与重要的生物学过程,例如基因的重组,DNA的复制、转录,RNA的翻译等。除了真核生物的G-四链体结构,近几年越来越多的研究报道病毒的基因组上存在形成G-四链体结构的序列。这些序列主要分布在病毒基因组的重复序列区、基因的调控区或者编码区,形成的G-四链体结构影响病毒基因组的复制、转录和翻译等。在本研究中,通过生物信息学分析,我们发现位于PRV基因组复制起点（Ori L）的上游存在两段倾向形成G-四链体结构的序列:Ori L-S和Ori L-A,这两段序列在32个PRV毒株中高度保守。通过圆二色光谱、凝胶电泳和硫酸二甲酯足迹保护试验,证明Ori L-S和Ori L-A序列可以在体外折叠形成平行的G-四链体结构。荧光共振能量转移和Taq聚合酶延伸阻滞试验表明小分子配体Phen DC3促进Ori L-S和Ori L-A序列形成G-四链体结构,并且提高其热稳定性。此外,以Phen DC3孵育退火后的PRV基因组为模板进行PCR扩增,结果表明PRV基因组上Ori L-S和Ori L-A区域可以形成G-四链体结构,并且Phen DC3能够稳定Ori L-S和Ori L-A序列形成的G-四链体结构。使用靶向性识别G-四链体的BG4抗体进行酶联免疫吸附试验和电泳迁移率试验,结果进一步表明Ori L-S和Ori L-A序列能够形成G-四链体结构。使用BG4抗体进行染色质免疫共沉淀试验,发现BG4抗体富集到了PRV基因组的Ori L-S和Ori L-A区域,该结果表明PRV在细胞内能够形成G-四链体结构。鉴于小分子配体Phen DC3可以促进并稳定Ori L-S和Ori L-A序列形成的G-四链体结构,而且证实PRV基因组的Ori L-S和Ori L-A区域可以在细胞内形成G-四链体结构,因此我们进一步研究小分子配体Phen DC3对PRV在宿主细胞内增殖的影响。病毒滴度检测和Western blot试验结果表明Phen DC3抑制PRV在细胞内增殖,流式细胞术检测发现Phen DC3对PRV增殖的抑制主要在细胞内的复制阶段,免疫荧光试验证明Phen DC3可以进入到细胞核内促进G-四链体结构的形成。不同时间点加药试验和q PCR检测结果进一步证实Phen DC3抑制PRV在细胞内的复制阶段。PRV感染细胞后加入Phen DC3,在不同的时间点提取细胞样品的总RNA,用RT-q PCR检测PRV的IE180、EP0和UL5基因的转录情况,结果表明Phen DC3抑制这些基因的m RNA表达,这些结果表明Phen DC3具有潜在的抗病毒作用。本课题进一步从G-四链体结构的结合蛋白方面研究了G-四链体结构在病毒复制和基因表达中的调控机制。通过Pull-down试验和串联质谱分析,从PRV病毒感染的PK-15细胞的核蛋白中筛选得到与Ori L-S和Ori L-A序列形成的G-四链体结构结合的宿主蛋白核仁素（Nucleolin,NCL）。通过对NCL基因过表达和用si RNA敲减,Western blot和流式细胞术检测结果表明,NCL对PRV的增殖具有负调控作用。综上所述,本研究发现并鉴定PRV基因组的复制起点（Ori L）上游的Ori L-A和Ori L-S序列可以形成G-四链体结构,并且小分子配体Phen DC3可以促进并且稳定Ori L-S和Ori L-A序列形成的G-四链体结构。同时Phen DC3抑制PRV基因组在细胞内的复制阶段从而抑制病毒在细胞内的增殖。最后,从G-四链体结构的结合蛋白方面探讨了G-四链体调控PRV增殖的分子机制,发现核仁素对PRV的增殖具有负调控作用。本研究不仅对PRV基因组的结构和基因表达调控方面提供了新的认识,而且为PRV新疫苗和药物研发提供了潜在的分子靶标。