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急性缺血性脑血管病是导致人类死亡的三大主要疾病之一,是致残的最主要原因。脑梗死核心区周围缺血半暗带神经元由于缺血/再灌注病理损伤机制大量死亡导致神经功能持续恶化,因此积极研究脑缺血/再灌注病理损伤机制和采取有效措施救治该区域濒临死亡的神经元对早期改善神经功能和降低致残率至关重要。大量研究表明,过度炎症反应是脑缺血/再灌注病理损伤过程的起始步骤和关键环节,贯穿始终,也是引起卒中后患者早期死亡和神经功能恶化的主要因素。核因子kB(Nuclear factor-κappa B,NF-kB)信号通路是炎症反应的启动通路和中心环节,掌握NF-κB信号通路调控机制则是脑缺血/再灌注早期抗炎治疗的关键所在。锌指蛋白A20是NF-κB信号通路上关键的负反馈抑制因子,是极具潜力的抑制NF-κB过度激活的治疗靶点。然而截止目前,对锌指蛋白A20在缺血/再灌注脑组织中的时空表达规律及其对炎性脑损伤的保护作用尚未见相关报道。针灸是祖国医学的瑰宝,是一种“内病外治”的医术。针刺通电治疗即为电针逐渐成为针刺治疗的主要形式。大量国内外研究表明,电针具有良好的抗炎效应,治疗缺血性脑血管病也有悠久的历史。虽然对电针治疗缺血性脑卒中炎症反应和调控NF-κB信号通路有不少报道,但国内外尚缺乏关于脑缺血/再灌注后电针调控锌指蛋白A20的研究,遗漏了电针发挥NF-κB信号通路抑制作用的核心机制。因此本研究包括三部分:(1)建立SD大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤模型,以缺血/再灌注后的脑组织炎性反应为切入点,以NF-κB信号通路中的关键性抗炎因子锌指蛋白A20为主要研究对象,采用基因沉默及过表达技术干预A20表达,明确A20在局灶性缺血/再灌注脑组织中的表达特征和对缺血性脑损伤发挥的作用;(2)进一步以电针干预为治疗手段,采用实验室相应检测方法,从基因和蛋白质等水平观察电针对锌指蛋白A20的调节作用及其抑制NF-κB信号通路过度激活的抗炎疗效,阐明A20参与电针调控NF-κB通路活性,减轻炎性损伤的作用机制;(3)观察局灶性缺血/再灌注脑组织神经元表达锌指蛋白A20与电针调节锌指蛋白A20在抑制过度炎症反应中的相互关系,探索电针调动神经元发挥的内源性脑保护途径。第一章锌指蛋白A20在SD大鼠局灶脑缺血/再灌注脑组织中的表达特点和对缺血性脑损伤的影响目的观察锌指蛋白A20在SD大鼠局灶脑缺血/再灌注脑组织中的表达特点和对缺血性脑损伤的作用。方法选用雄性SD大鼠建立右侧大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型,大鼠被分成5组:假手术(Sham)组、单纯缺血/再灌注模型(MCAO)组、A20过表达(MCAO+LV-A20)组、A20沉默(MCAO+LV-sh A20)组和空病毒载体(MCAO+Vehicle)组,分别采用实时荧光定量多聚酶链反应(RT-q PCR)、蛋白免疫印迹(Western-blot)和免疫荧光方法检测锌指蛋白A20在脑组织中时空表达特点。建立以慢病毒为载体的锌指蛋白A20基因过表达和沉默体系,通过侧脑室注射转染SD大鼠脑组织,分别检测局灶脑缺血/再灌注后锌指蛋白A20表达变化对大鼠神经功能评分、脑梗死体积的影响。结果(1)时间表达特点:再灌注各时间点(6、12、24、48、72 h)通过RT-q PCR和Western-blot检测发现锌指蛋白A20在Sham组大鼠脑组织表达很少,而在MCAO大鼠模型组从再灌注6 h开始脑组织中A20 m RNA表达较Sham组明显升高(各时间点均P<0.001),高峰期出现在再灌注24 h,之后迅速下降,到再灌注72 h与Sham组相比无显著性差异(P>0.05);相似地,Sham组大鼠脑组织中锌指蛋白A20蛋白水平也处于微量表达水平,单纯缺血/再灌注后锌指蛋白A20蛋白合成增多,但仅在再灌注12、24、48 h三个时间点较假手术组明显升高(分别为P<0.05,P<0.001,P<0.05)。(2)空间表达特点:通过免疫荧光染色(Immunofluorescence IF)标示出锌指蛋白A20在各组大鼠脑组织中的空间分布。我们发现在Sham组大鼠脑组织中几乎没有锌指蛋白A20阳性表达,而在再灌注24 h,MCAO组大鼠脑组织中出现明显增多的锌指蛋白A20阳性表达细胞,主要位于局灶缺血/再灌注大脑皮层区,与Sham组相比,锌指蛋白A20阳性细胞计数具有统计学差异(P<0.001);为进一步明确脑组织中A20表达的主要细胞类型,我们采用免疫荧光双标法检测表明大鼠局灶脑缺血/再灌注区皮层神经元是锌指蛋白A20上调表达的主要细胞类型。(3)锌指蛋白A20在局灶缺血/再灌注脑损伤中发挥的作用:我们发现,再灌注6 h,各组大鼠神经功能评分没有显著性差异;然而再灌注72 h,各组大鼠神经功能评分出现差异性:相比于单纯缺血/再灌注(MCAO)组,A20过表达(MCAO+LV-A20)组神经功能评分显著提高(P<0.05);而A20沉默(MCAO+LV-sh A20)组大鼠的神经功能评分则显著低于单纯缺血/再灌注(MCAO)组(P<0.05);相应地,再灌注72h,A20过表达(MCAO+LV-A20)组大鼠脑梗死体积显著小于单纯缺血/再灌注(MCAO)组(P<0.001);而A20沉默(MCAO+LV-sh A20)组大鼠的脑梗死体积则明显大于单纯缺血/再灌注(MCAO)组(P<0.001)。结论局灶性脑缺血/再灌注可以刺激脑组织表达锌指蛋白A20,上调表达的锌指蛋白A20主要位于局灶脑缺血/再灌注区皮层神经元;锌指蛋白A20对大鼠局灶脑缺血/再灌注神经功能和脑损伤具有保护作用。第二章电针对SD大鼠局灶脑缺血/再灌注脑组织锌指蛋白A20的调节作用及A20对电针治疗缺血性炎性脑损伤的影响和机制目的观察电针对SD大鼠局灶脑缺血/再灌注脑组织锌指蛋白A20表达的调节作用,阐明锌指蛋白A20是否是电针抑制NF-κB信号通路介导的缺血性炎性脑损伤的关键靶点和重要机制。方法选用雄性SD大鼠建立右侧大脑中动脉局灶缺血/再灌注模型,大鼠被分成5组:假手术(Sham)组、单纯缺血/再灌注模型(MCAO)组、电针(MCAO+EA)组、A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组和空病毒载体电针(MCAO+EA+Vehicle)组,利用一定频率和强度的电针对大鼠的“百会”穴和“四关”穴进行刺激,分别采用RT-q PCR、Western-blot和免疫荧光方法检测电针对锌指蛋白A20在脑组织中时空表达的影响;将携带A20-sh RNA的慢病毒通过侧脑室注射转染大鼠脑组织介导锌指蛋白A20基因沉默,分别检测局灶脑缺血/再灌注后电针干预锌指蛋白A20表达变化对大鼠神经功能评分、脑梗死体积、脑组织中炎症因子(TNF-α和IL-β)水平、胶质细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)激活状态以及NF-κB信号通路重要位点蛋白κB抑制蛋白(IκBα)、IκB激酶(IKKβ)磷酸化和核因子p65(NF-κBp65)核转位的影响。结果(1)电针对锌指蛋白A20的调节作用:通过RT-q PCR和Western-blot检测发现,从再灌注6 h开始,各时间点MCAO+EA组大鼠A20 m RNA表达水平均较MCAO组明显增高(各时间点均P<0.001),高峰期提前到再灌注12 h,并且直到再灌注72 h仍维持相对较高表达水平;相似地,从再灌注12 h开始,各时间点MCAO+EA组大鼠锌指蛋白A20蛋白表达水平均较MCAO组明显增高(分别为P<0.001,P<0.001,P<0.01,P<0.01);通过免疫荧光染色发现,相比于MCAO组,MCAO+EA组大鼠局灶缺血/再灌注皮层区A20阳性表达细胞增多更为明显(P<0.001)。(2)锌指蛋白A20对电针脑保护作用的影响:于再灌注72 h,我们发现同单纯缺血/再灌注(MCAO)组相比,电针(MCAO+EA)组大鼠神经功能评分明显升高(P<0.05),脑梗死体积明显减小(P<0.001),而A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组大鼠同电针(MCAO+EA)组相比,神经功能评分明显降低(P<0.001),脑梗死体积明显增大(P<0.001)。(3)锌指蛋白A20对电针抗炎作用的影响:于再灌注24 h,用ELISA法测量脑组织TNF-α和IL-1β水平,我们发现,单纯缺血/再灌注(MCAO)组大鼠脑组织TNF-α和IL-1β浓度均比假手术(Sham)组升高(分别为P<0.001,P<0.001),电针(MCAO+EA)组大鼠脑组织TNF-α和IL-1β浓度均比单纯缺血/再灌注(MCAO)组明显下降(分别为P<0.05,P<0.001),而TNF-α和IL-1β在A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组大鼠脑组织水平显著高于电针(MCAO+EA)组(分别为P<0.001,P<0.001);采用RT-q PCR法检测脑组织中GFAP和A1 m RNA表达水平反映胶质细胞的激活程度,我们发现单纯缺血/再灌注(MCAO)组大鼠脑组织GFAP和A1 m RNA表达水平均比假手术(Sham)组升高(分别为P<0.001,P<0.001),电针(MCAO+EA)组大鼠脑组织GFAP和A1 m RNA表达水平均比单纯缺血/再灌注(MCAO)组明显下降(分别为P<0.001,P<0.05),而GFAP和A1 m RNA在A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组大鼠脑组织的表达水平显著高于电针(MCAO+EA)组(分别为P<0.001,P<0.001);通过免疫荧光染色显示胶质细胞的激活状态,我们发现A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组大鼠脑组织中胶质细胞激活形态最明显,数量最多;单纯缺血/再灌注(MCAO)组次之;电针(MCAO+EA)组最少。假手术(Sham)组脑组织中的胶质细胞呈静息状态,胶质细胞的形态学改变与这几组的GFAP和A1 m RNA表达水平相一致。(4)锌指蛋白A20对电针抑制NF-κB信号通路的影响:再灌注24 h,采用Western blotting法检测发现,同单纯缺血/再灌注(MCAO)组相比,电针(MCAO+EA)组大鼠脑组织A20蛋白水平明显增高(P<0.05),相应地,IKKβ和IκBα磷酸化率以及NF-κB p65核转位率受到显著抑制,差异有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.001,P<0.01),随着A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组大鼠脑组织A20蛋白水平明显下降,IKKβ和IκBα磷酸化率以及NF-κB p65亚单位核转位率均出现明显升高,与电针(MCAO+EA)组相比,具有显著性差异(分别为P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001);采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry IHC)检测发现,MCAO组大鼠局灶性缺血/再灌注脑组织大部分细胞胞浆和胞核均有明显NF-κB p65阳性染色,电针(MCAO+EA)组大鼠局灶性缺血/再灌注脑组织NF-κB p65阳性染色主要位于胞浆,而A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组大鼠局灶性缺血/再灌注脑组织NF-κB p65阳性染色充满于整个胞浆胞核。结论电针能够明显上调SD大鼠局灶缺血/再灌注脑组织皮层神经元锌指蛋白A20表达,锌指蛋白A20是电针抑制NF-κB信号通路介导的缺血性炎性脑损伤的关键靶点和重要机制。第三章局灶脑缺血/再灌注脑组织皮层神经元与电针调节锌指蛋白A20在抑制过度炎症反应中的相互关系目的明确局灶脑缺血/再灌注脑组织皮层神经元与电针调节锌指蛋白A20在抑制过度炎症反应中的相互影响和作用。方法按前述方法将大鼠分为4组:单纯缺血/再灌注(MCAO)组、电针(MCAO+EA)组、A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组和空病毒载体电针(MCAO+EA+Vehicle)组,时间点为再灌注24 h。采用免疫荧光双标法(Double-IF)显示电针调节锌指蛋白A20表达抑制NF-κBp65核转位对局灶性缺血/再灌注脑组织皮层神经元形态学的影响。通过免疫荧光法将各组A20阳性神经元细胞计数后,采用Pearson相关性分析分别配对统计A20阳性神经元细胞计数与神经功能评分、脑梗死体积、脑组织TNF-α和IL-1β水平以及GFAP和A1 m RNA表达水平的相关性。结果(1)Double-IF显示,再灌注24h,MCAO组大鼠缺血/再灌注脑组织皮层中多种细胞均表达NF-κBp65,尤其大量神经元胞浆胞核中均有明显的NF-κBp65阳性表达,神经元排列松散,部分细胞胞体肿胀;电针(MCAO+EA)组大鼠缺血/再灌注脑组织皮层NF-κBp65表达虽然丰富,但多数局限于胞浆中,且神经元排列紧密有序。而A20沉默加剧了NF-κBp65核转位,可以看到A20沉默电针(MCAO+EA+LV-sh A20)组绝大多数神经元胞浆胞体均显示致密的NF-κBp65荧光,伴随胞体萎缩胞核破碎,细胞排列稀疏,数目明显减少。(2)再灌注24 h锌指蛋白A20阳性神经元细胞计数与神经功能评分呈显著性正相关(n=20 pairs,r=0.8140,P<0.0001),而与脑梗死体积呈显著性负相关(n=20 pairs,r=-0.7591,P<0.0001),分别与脑组织TNF-α和IL-1β浓度以及GFAP和A1 m RNA表达水平均呈显著性负相关(分别为n=20 pairs,r=-0.8527,P<0.0001;n=20 pairs,r=-0.8362,P<0.05;n=20 pairs,r=-0.8704,P<0.0001;n=20 pairs,r=-0.8209,P<0.0001)。结论大鼠局灶脑缺血/再灌注脑组织皮层神经元是电针调节锌指蛋白A20表达抑制NF-κB p65核转位发挥抑制炎性脑损伤的主体和平台,而电针调节锌指蛋白A20表达抑制神经元NF-κB p65核转位则能有效阻止局灶性缺血/再灌注脑组织皮层神经元形态学的破坏。