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第一部分溶瘤柯萨奇病毒的筛选与评价肠道病毒（Enterovirus,EV）是一类单股正链RNA病毒,包括柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒等,能够导致手足口病（HFMD）、疱疹性咽峡炎、脊髓灰质炎等疾病。因EV的复制周期较短,能够迅速感染某些肿瘤细胞系产生细胞病变效应并使其死亡。目前已报道多种具有溶瘤作用的EV,如柯萨奇病毒A21等,但大多用于治疗恶性黑色素瘤等欧美地区高发的肿瘤,应用于肺癌、肝癌等亚太地区高发肿瘤类型的研究较少。本研究发现一株能应用于肺癌治疗的溶瘤病毒CV-B5/Faulkner（Gen Bank:AF114383）,并对溶瘤机制进行了探讨。研究结果显示,用CV-B3/Nancy,CV-B3/112,CV-B5/Faulkner,CV-B5/JS417,CV-A6/Gdula分别感染肺癌细胞系、正常肺组织细胞系、肝癌细胞系、正常肝细胞系和宫颈癌细胞系后,仅CV-B5/Faulkner和CV-B5/JS417具备选择性感染肺癌细胞而不感染正常肺组织细胞的双重特性。使用梯度稀释的CV-B5/Faulkner可在肺癌细胞（A549、H1299、NCI-H460）上表现出明显的剂量依赖效应;使用100 MOI的CV-B5/Faulkner感染正常肺组织细胞系（MRC-5、KMB-17、2BS）后的细胞活性与正常细胞对照相比无统计学差异（P>0.05）。免疫印迹实验和流式细胞术结果均表明,CV-B5的主要受体腺病毒-柯萨奇病毒受体（CAR）只表达于肺癌细胞表面,这在一定程度上保证了CV-B5的选择感染能力。应用人肺癌细胞A549、H1299、NCI-H460建立了BALB/c裸鼠的荷瘤动物模型。当肿瘤直径达到4-5mm时,通过连续五次瘤内给予(每次5×106TCID50)CV-B5/Faulkner,可以完全抑制乃至治愈H1299肿瘤（P<0.01）,显著抑制A549肿瘤（P<0.05）,但对NCI-H460肿瘤无明显效果（P>0.05）。应用不同针次治疗H1299肿瘤的结果表明,仅使用一针次或三针次病毒就可完全抑制直径4-5mm或8-9mm的H1299肿瘤,并且能延长小鼠30-90天的生存时间。为验证CV-B5的远端治疗靶向性构建了双侧生长A549或H1299细胞的裸鼠模型,发现单侧给予CV-B5可以明显抑制对侧肿瘤的生长,差异与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。CV-B5治疗后小鼠脑、肺、肝、胰腺、脾、肾脏、心脏等主要脏器未发现明显的组织病理学改变,为CV-B5作为溶瘤病毒的安全性提供了数据。此外,本研究表明CV-B5/Faulkner溶瘤作用依赖于病毒诱导的凋亡途径的级联活化。单独应用0.1MOI CV-B5/Faulkner在细胞水平不能明显溶瘤NCI-H460细胞。将多种信号途径抑制剂分别与CV-B5联用,在细胞水平筛选出了蛋白激酶B（PKB）通路的抑制剂可以显著增强CV-B5的溶瘤作用（P<0.05）。研究发现CV-B5/Faulkner毒株可能通过CAR受体途径特异性感染并溶解肺癌细胞系,体内溶瘤实验显示良好的溶瘤效果,通过病毒诱导凋亡途径的级联活化发挥溶瘤作用,PKB通路抑制剂可增强CV-B5对不敏感肿瘤细胞的溶瘤作用,显示CV-B5/Faulkner具有进一步研发成为溶瘤疫苗的潜力。第二部分柯萨奇病毒A组16型通用抗原定量检测方法的建立与验证柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CV-A16）是EV A组成员之一,可引起轻症和重症HFMD。目前国内多家企业致力于CV-A16疫苗的研发。CV-A16抗原含量的定量测定是疫苗研发、质控和评价的关键环节。目前全球缺乏通用的CV-A16抗原定量检测方法,为疫苗研发和评价提出挑战。本研究采用酶联免疫吸附实验法建立CV-A16通用抗原定量检测方法。筛选到一株构象性单克隆抗体16E1,可以中和CV-A16 B1b和B2b亚型毒株（滴度≥9600）;广泛结合CVA16 B1a,B1b和B2b等亚型抗原（S/CO>30）;应用10μg/g 16E1可以100%保护乳鼠免于致死剂量CV-A16/BJCA08病毒攻击。本研究通过摸索相关参数,以CV-A16国家抗原标准品（CV-A16 NS）为参考物质,建立了以16E1为包被抗体,一株兔源多抗（中和效价为1:6144、结合效价为106）为二抗的检测体系,并采用平行线分析法统计结果。方法学验证结果显示,本检测试剂不与EV-A71等其他肠道病毒交叉反应,线性范围为12.5-200U/ml,不同浓度标准品的回收率为80-115%,重复性和中间精密度CV值均小于15%,以上参数均满足药典相关要求。适用性研究纳入了国内六个CV-A16灭活疫苗研发企业,毒株类型包含B1a、B1b、B2a、B2b等,由各企业独立完成原液、收获液、纯化液的抗原检测。结果表明,6个不同CV-A16疫苗原液的平行性和线性与CV-A16 NS相比均无显著性差异（P>0.05）,且不同样本拟合曲线的斜率波动较小（-0.85-1.25）,说明本方法可用于检测不同工艺、毒株的疫苗原液中的抗原含量。此外,同一厂家的收获液、纯化液和原液的平行性与线性与CV-A16 NS相比无显著性差异（P>0.05）,且三条曲线的斜率差异较小（-0.97-1.04）,说明本检测体系不易受到样本中其他成分的干扰,可用于检测不同工艺阶段产品中的有效抗原含量。本研究采用具有高效价和广谱中和能力的CV-A16构象单抗,通过单抗-多抗双抗体夹心法建立了CV-A16疫苗抗原检测试剂盒,经方法学验证,特异性、重复性、精密度良好,经6个实验室、3个工艺阶段制品适用性研究,证明该试剂盒对不同基因型、不同工艺制品均具有良好适用性,可作为CV-A16疫苗抗原通用试剂盒,可保证CV-A16灭活疫苗抗原活性、有效性评价的准确性、重复性及可比性,为促进我国CV-A16疫苗研发提供工具。