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本文通过对水产品致病菌——副溶血性弧菌(VibrioParahaemolyticus)的致病株C4株系进行多轮超高压筛选,得到相应的耐压菌株N11。接着以C4和N11菌株为研究对象,分析了超高压处理对这2株细菌的细胞壁膜影响、细胞损伤情况、以及耐压菌株的耐压机理。进而利用Seq-RNA测序技术分析超高压胁迫下这2株菌内的差异表达基因,结合基因组数据筛选出的耐压菌株N11中的突变碱基位点,采用实时荧光定量PCR技术考察了差异表达基因和突变位点调控的基因在超高压胁迫下的表达规律,从分子水平探讨了副溶血性弧菌对超高压的耐受机理。具体结论如下: (1)研究了副溶血性弧菌原始菌株C4株和耐压菌株N11株对超高压的耐受性,在200 MPa以上(含200 MPa)压力处理时,C4株全部死亡,N11株有少量细菌存活。 (2)分析超高压处理对C4和N11菌株细胞膜通透性、Na+/K+-ATP酶活、表面zeta电位、细胞超微结构、胞内CAT酶活性的影响。结果表明超高压可破坏细胞壁膜的结构,造成细胞膜通透性增加、酶活性降低、细胞内容物泄漏、细胞拟核凝聚和低电子区等现象;在相同压力的超高压胁迫下,C4株细胞壁膜的破坏程度较耐压菌株高,超高压杀菌的主要原因可能是通过损伤细胞壁膜发挥作用;N11株中的过氧化氢酶对超高压有更高的抗逆性,进而提高了菌株对超高压的耐受性。 (3)采用RNA-Seq测序技术分析了C4和N11菌株在超高压胁迫前后的转录组结果,从中筛选出一系列的差异表达基因。进而对这些差异表达基因进行COG和WEGO功能分析,发现在压力胁迫条件下,野生型菌株C4内与细胞膜结合蛋白、代谢及生物调控过程等相关的基因表达水平发生明显变化,同时,与无机盐离子转运与代谢、抗氧化作用、细胞杀伤作用相关基因的表达发生了下调,这可能是导致副溶血性弧菌的细胞膜遭到破坏,继而诱发细菌死亡的重要原因;而耐压菌株在压力胁迫时,与细胞活力、转运蛋白、生物过程调控相关的基因转录水平明显发生提高、此外还有含CBS结构域膜蛋白、ABC型磷酸盐转运系统、50S核糖体蛋白、周质蛋白相关基因的表达也发生了上调,这都有助于耐压菌株N11对超高压胁迫的耐受能力。 (4)对上述差异表达基因进行KEGG通路分析,发现经超高压处理后,与野生型C4株相比,耐压菌株N11对碳源和氨基酸的利用能力有所降低,且能量合成量减少。 (5)对野生型C4和耐压菌株N11之间进行全基因组的比较分析,从N11株中预测出编码区内有8个基因共16个核苷酸位点发生了突变,非编码区内有22个核苷酸位点发生了突变。进而,在这些突变位点两侧设计引物,通过PCR扩增和测序,最终鉴定出18个碱基位点发生了突变,它们均位于非编码区,推测这些突变的碱基位点可能通过影响上下游基因的表达水平,从而来增强细胞的耐受超高压能力。 (6)采用实时荧光定量PCR考察突变位点上下游基因在野生型C4和耐压菌株N11之间的表达水平,发现C4_4362基因在C4株中表达量显著下调可提高其对压力敏感性;C4_4609基因的表达产物在细胞内大量表达可能会导致菌株死亡;基因C4_4522编码的蛋白目前功能尚不明确,但可推测其表达水平下调可提高耐压菌株的耐受能力;基因C4_4795在菌株对压力耐受能力的调节中可能起负调控作用;C4_4363和C4_4794基因与菌株的耐压能力无关。