小麦Mlo基因RNAi表达载体的构建和反义表达植株后代的分子检测

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小麦白粉病是由专性寄生真菌—小麦白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.Tritici)引起的一种全球性危害小麦的严重病害,对小麦的产量和品质有着极大的影响。施用农药虽然能在一定程度上减轻病害,但却严重危害生态环境和产品。白粉菌生理小种众多,变异速度很快,常规育种获得的小麦抗性品种往往因为白粉菌生理小种的变异而失去抗性,这就大大缩短了品种的使用年限,因此利用基因工程方法选育广谱抗白粉病品种可能是最为经济和有效的方法。研究表明大麦Mlo基因的隐性突变mlo可以使大麦对几乎所有已知大麦白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.hordei)生理小种产生持久、广谱的抗病性。小麦是大麦的近缘种,而且二者的Mlo基因的cDNA有92%的同源性,因而它们有着相似的作用机制。本实验室已获得小麦Mlo基因cDNA片段(长1434bp),所以可以通过RNAi技术或者反义技术关闭或者减弱植物本身Mlo基因的表达,赋予植物抗病性。 RNAi是一种抑制基因表达的技术手段,所具有的特异性、稳定性、高效、快速等特性为研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段,在应用研究中也发挥着越来越重要的作用。本研究分别在小麦Mlo基因cDNA片段(1434bp)编码区的5’和3’(对应于小麦MLO蛋白的N端和C端)选择抑制效率较高的部分,构建了植物RNAi表达载体pRI-Nmlo和pRI-Cmlo,并转化了小麦优质品种烟优361。 我们还对小麦Mlo基因cDNA片段的反义表达载体pRAL-anti-mlo转基因T0、T1、T2代植株进行了分子检测。从生物安全性的角度考虑,我们所使用的植物表达载体不含选择标记基因,所以不能通过抗生素或者除草剂进行筛选,而只能运用分子检测和表型鉴定来选择转基因阳性植株。由于我们使用小麦Mlo基因cDNA片段,理论上应该可以与植株内源的含内含子的基因组序列相互区分,但是小麦是异源六倍体,基因组情况比较复杂,推测可能含有多个Mlo同源基因,构成一个基因家族,这种基因组背景的复杂性为转基因的检测带来不少的困难,经过摸索,采用巢式PCR的方法进行检测。
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