背景和目的肝切除术是治疗肝脏良恶性肿瘤的首选方法。随着围手术期管理水平的不断提高、手术技术的不断进步,尤其是精准外科理念的不断深入,肝切除术的手术适应证及切除范围不断扩大,以往认为无法切除的肝脏巨大肿瘤、多发肿瘤以及肝门区肿瘤在今天得以切除,使患者长期无瘤生存成为可能。然而,尽管扩大切除范围能够完整的切除肿瘤并获得阴性切缘,但大范围切除术后由于预留的功能性肝体积不足,常常导致术后肝功能衰竭的发生,这是患者术后死亡的主要原因,严重限制了大范围肝切除在临床的应用。尽管大范围肝切除术后肝功能衰竭是一种严重的临床综合征,但其具体的病理生理机制仍未完全明了。术后肝衰发生的本质在于残余肝脏再生与损伤的不协调导致的功能性肝细胞簇数量不足。门脉高灌注、Kupffer细胞激活、肠道菌群异位、过度的炎症反应以及氧化应激反应是造成实质损伤的主要原因,对于这些因素进行相应的干预能在一定程度上改善大范围肝切除术的预后。然而残余肝脏的再生在术后肝衰的病理生理过程中所起的作用,目前研究尚未达成统一观点。有些研究认为,由于实质细胞与非实质细胞的再生进程不同步,大范围肝切除术后早期过快的肝再生反而促进门脉压力的进一步升高,无益于残余肝脏组织结构的重建。但是另有研究也发现大范围肝切除术后残余肝脏的再生表现为明显抑制,同时,促进肝再生的措施也能显著提高术后生存率。因此,明确残余肝脏组织再生进程的变化,对于进一步认识大范围肝切除术后肝功能衰竭的病理生理机制及发掘潜在的治疗策略意义重大。肝切除术后残余肝脏的再生是受到精确调控的复杂生理过程,细胞因子、生长因子及代谢产物共同构成肝再生的调控网络。肝脏是机体的代谢中枢,肝切除术后残余肝脏组织一方面要维持肝脏特异性功能,如糖异生、尿素合成等,另一方面也要产生大量ATP,不仅用于蛋白、核酸及其他细胞成分的合成,也参与重要的再生相关信号通路的活化。肝切除术会严重影响肝脏的代谢功能,尤其是能量代谢。因此,能量代谢的异常可能通过再生进程的调控参与术后肝衰的病理生理过程。mTOR信号通路通过整合胞内能量状态、氧含量以及胞外生长因子、营养物质等信息,调控细胞的代谢以及生长增殖过程。当能量及营养物质来源充足时,该信号通路能够促进细胞的生长；反之,在能量状态低下的情况下,细胞转向能量恢复的过程。基于以上认识,我们设想大范围肝切除术后由于剩余肝脏组织代谢功能的紊乱导致能量状态的显著低下,可能干扰了mTOR信号通路,继而抑制残余肝脏细胞的再生,导致或者促进肝功能衰竭的发生。本课题拟通过建立不同范围肝切除的大鼠模型,研究不同范围肝切除术,尤其是90%肝切除术后残余肝脏的再生与损伤改变,探讨能量代谢对mTOR信号通路以及残余肝脏再生的影响及机制；以及改善能量状态对大范围肝切除术后肝再生的影响。为临床改善大范围肝切除术后患者的肝功能和预后,提高肝脏肿瘤的手术切除率提供理论基础。方法本课题实验分三部分进行：第一部分：基于精准外科理念,建立不同范围肝切除的大鼠模型,初步观察术后肝功能、血生化及组织病理学变化和术后肝衰的发生率及死亡率,选出合适的大范围肝切除术后肝功能衰竭的标准化模型。第二部分：将大鼠分为假手术组、85%肝切除组(大范围肝切除无肝功能衰竭组)和90%肝切除组(大范围肝切除肝功能衰竭组)。对比85%肝切除组和90%肝切除组术后生存率、肝功能、肝再生及实质损伤的相关指标的变化。检测mmTOR信号通路活性在两组的差异。第三部分：进一步检测mTOR信号通路的上下游分子的活性在85%和90%肝切除组的差异。用代谢组学的方法探讨90%肝切除术后大鼠全身代谢水平的改变。我们选择葡萄糖作为治疗组干预药物,探讨改善能量状态对90%肝切除术后mTOR信号通路及残余肝脏再生和预后的影响。结果第一部分：成功建立了大鼠不同范围肝切除的标准化模型。与其它组相比,90%肝切除术后大鼠肝功能障碍更加明显,表现为血清ALT、AST、TBIL水平的明显升高,ALB水平明显降低。70%和85%肝切除术后大鼠的生存率均为100%,而90%肝切除术的生存率明显降低,仅为23%。对死亡大鼠进行尸检,见腹腔内少量至中等量淡黄色腹水,尾叶肿胀,表面颜色略有苍白,并可见扩张血管,未发现出血、胆漏、腔静脉狭窄等并发症,证实死于肝功能衰竭。病理学检测发现肝切除术后24小时残余肝脏表现为肝小叶基本结构存在,肝血窦拥塞,肝细胞表现为明显的空泡样变,但在70%、85%和90%肝切除组之间未发现明显的差异,同时,三组也未出现明显的肝细胞坏死表现。第二部分：1.与假手术组相比,85%肝切除组与90%肝切除组术后大鼠血清ALT、AST水平及HMGB-1的mRNA水平均显著升高,但两组之间的差异无统计学意义；组织病理学检测显示术后24小时两组残余肝叶组织肝小叶结构基本正常,肝细胞空泡变明显,无炎性细胞浸润、坏死等病理改变,中性粒细胞标志物-MPO染色进一步证实两组无明显的中性粒细胞浸润；TUNEL染色显示两组仅有少量TUNEL阳性细胞，Western blot结果显示caspase-3蛋白表达在两组之间无差异。2与假手术组相比,85%肝切除组与90%肝切除组术后残肝都表现出明显的再生反应,但后者的再生率明显低于前者,术后24小时有丝分裂指数表现出相同的趋势；肝组织再生相关因子的nRNA表达情况：TNF-α、myc和HGF的mRNA表达在两组之间无明显差异,IL-6的mRNA表达水平在90%肝切除组明显上调；细胞周期相关因子(cyclinD、cyclinE、cyclinA、cyclin B)的1nRNA的表达,在90%肝切除组明显低于85%肝切除组；肝组织Ki-67结果显示,两组术后均有不同程度的细胞增殖,且90%肝切除组的阳性率明显低于85%肝切除组。肝组织PCNA蛋白的VVesternb1ot结果显示出类似的变化趋势。3Western blot检测各组mTOR及其下游分子p70s6k、4EBP1的磷酸化水平,结果发现90%肝切除术后mTOR、p70s6k和4EBP1的磷酸化水平明显下调,提示该通路的激活出现异常。第三部分：1.Western blot结果显示,与85%肝切除组相比,90%肝切除组AMPKa的磷酸化水平明显上调,而cyclin D蛋白的表达显著降低。Akt的磷酸化水平两组之间无明显差异。磷钼酸比色法检测肝组织ATP含量,结果显示：术后早期90%肝切除组残余肝组织ATP含量明显低于85%肝切除组。2.代谢组学结果显示90%肝切除术严重干扰了大鼠的代谢,尤其是能量相关的代谢通路发生了明显改变。3.葡萄糖干预显著提高90%肝切除术后残余肝组织ATP水平,残余肝脏的再生率及有丝分裂指数显著提高,组织病理学检测显示Ki-67阳性率明显升高,Western blot的结果PCNA、cyclin D的蛋白表达水平及mTOR信号通路活性明显提高。结论：1.基于实验室前期的工作,在充分了解大鼠肝脏及管道系统解剖的基础上,规范手术步骤和方法,精确地处理大鼠肝脏实质内入肝血流及肝静脉等重要结构,成功建立了稳定的不同范围肝切除的标准化模型。2.利用我们的方法建立的大鼠90%肝切除模型术后早期发生急性肝功能衰竭,表现为肝脏排泄、合成及代谢功能的明显障碍,死亡率高但有一定的自愈率等特点,能够很好的模拟肝切除术后肝功能衰竭的临床表现,是一个符合外科临床实际的理想模型。3.再生早期启动因子的明显上调说明90%肝切除诱导了强烈的再生信号,但细胞增殖周期相关因子的结果提示残余肝脏并未表现出同样强烈的增殖能力。残余肝脏的再生抑制是导致90%肝切除术后肝功能衰竭的主要原因。4.代谢组学的结果证实90%肝切除造成严重的代谢紊乱,严重影响了能量的产生,表现为90%肝切除术后残余肝脏的ATP含量的明显降低。低能量状态通过AMPK的激活抑制了mTOR信号通路,继而造成残余肝脏的再生抑制。5.提高90%肝切除术后的能量状态能够促进残余肝脏的再生,并延长大鼠术后生存时间及生存率,改善大范围肝切除术的预后。6.能量的产生涉及多个方面,比如线粒体是否能够维持正常的氧化磷酸化及电子传递的功能,是否足量恰当的能量代谢底物的供应等。因此需要进一步探讨大范围肝切除术后能量代谢异常的原因,以更加有效的改善围手术期能量状态,改