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目的 研究糖尿病大鼠不同病程心肌胶原蛋白和骨架蛋白含量的变化，阐明两者对糖尿病心肌病变发生的作用以及研究钠／氢交换抑制剂对糖尿病心肌细胞钙超载的影响。 方法 1．制造糖尿病大鼠心肌模型：体重250-300gSpraque-Dawley（SD）大鼠36只，其中18只健康大鼠。18只经腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma公司）60mg·Kg-1，7天后测定血糖≥16.7mmol／L为糖尿病大鼠。随机分为六组：糖尿病大鼠1个月组（DM1）、糖尿病大鼠3个月组（DM3）、糖尿病大鼠6个月组（DM6）和健康大鼠1个月组（C1）、健康大鼠3个月组（C3）、健康大鼠6个月组（C6）。每组大鼠各6只随机筛选入实验。各组分别于糖尿病大鼠模型成功后1个月、3个月和6个月进行腹腔内注射1.5％戊巴比妥(5mg·Kg-1)进行麻醉后，打开胸腔，摘取心脏，切取左心室4mm厚组织两块，将一份标本立即放入冻存管中，放入液氮中保存，待测心肌羟氨酸含量；一份标本4℃10％福尔马林固定24h，PBS冲洗，进行石蜡包埋，待测心肌细胞内胶原蛋白和转化生长因子β1（TGF-β1）及肌动蛋白含量。 2．测定心肌胶原总含量：以心肌羟氨酸水平来代表心肌胶原总含量。以氯胺T法测定羟脯氨酸含量。称取冰冻左心室心肌组织100mg，网搓匀浆后将组织粉末置于6M的HCL液2ml中125℃酸解5h，然后用6M的NaOH液滴定至pH为7，然后2000r.min-1离心10min，取上清液1ml加柠檬酸缓冲液0.5ml，再加0.05M氯胺T 1ml，混匀氧化6min；然后加3.15M的过氯酸1ml，混匀放置5min；再加10％对二氨苯甲醛1ml80℃水浴6min，取出后冰水浴30min；最后一步UV-1206型分光光度计560nm处比色测定。同时用1μg～10μg的羟脯氨酸标准品按上述相同步骤制作标准曲线。对照标准曲线，求得羟脯氨酸含量，然后换算成每克心肌组织中羟脯氨酸含量，再乘以7.46即得心肌胶原总含量。 3.心肌免疫组织化学染色:用于Collagenl、Collagen 111、TGF一p:和心肌型a肌动蛋白（a一actin）检测。采用石蜡切片，切片厚6林m抗原染色如下程序:（l）载玻片防脱片剂处理:选用Poly一场sine。捞片后置烤箱60℃30 min以使切片紧密粘附。（2）切片常规脱蜡至水。（3）蒸馏水新鲜配置3%HZO:，室温5 min一1 0 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。（4）热修复抗原:将切片浸人0 .olM构椽酸盐缓冲液（PH6.0），电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5 min一10而n后，反复l一2次。冷却后PBS洗涤1一2次。（5）滴加正常羊血清封闭液，室温20而n。甩去多余液体，不洗。（6）滴加l:100稀释一抗（小鼠或兔IgG），4℃过夜。PBS洗2分钟x3次。（7）滴加生物素化兔抗小鼠I步，20℃一37℃20而n。PBS洗2而n x3次。（8）滴加试剂SABC，20℃一37℃20 min。PBS洗5而n x4次。（9）DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取ld蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混解剖学后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，约在30而n。蒸馏水洗涤。（10）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。 4.采用显微图象分析仪（MetaMorp丫DP10/BX51型）进行Coilagenl、Conagen nl、TGF一p;和心肌型a一actin蛋白积分光密度分析，每组大鼠随机取10一40个400倍显微镜视野图象，计算平均积分光密度（inter目卫tedoptical density，IOD）。 5.光镜标本的制备:石蜡包埋心肌标本切片，切片厚4卿，做心肌胶原MASSON染色。显微镜下观察心肌胶原分布。 6.透射电镜标本的制备:心肌标本用饿酸固定，PBS洗5而n x4，酒精梯度脱水（30%、50%、70%），丙酮梯度脱水（80%、90%、100%）。环氧树脂浸透包埋，温箱聚合，超薄切片（70nm），透射电镜观察、摄片。 7.糖尿病鼠心肌细胞的培养:出生5天体重l飞一22gspra四e一Dawley（SD）系鼠100只，经腹腔注射链脉佐菌素（streptozotocin，S犯，519口a公司）60mg·Kg一’，7天后测定血糖〕16.7心L为糖尿病鼠，2周内存活18只用于实验。实验动物空腹状态下，测定血糖)16.7FL，进行腹腔内注射1.5%戊巴比妥（smg·Kg一‘）进行麻醉，然后打开胸腔，在无菌条件下，摘取心脏，取出糖尿病鼠的心尖部组织，切成约（1一2）恤3大小的碎块，用0.125%胰蛋白酶溶液分次消化，离心，将收集到的心肌细胞用含巧%胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮（含青霉素，链霉素，pH7.4），置于37℃、含有5%C02的细胞培养箱内孵育90 min，进行差速贴壁，以除去非心肌细胞，接种于50ml的一次性培养瓶中，每瓶细胞数要求达到（6一8） x 106个，在二氧化碳培养箱中培养（37℃，95%空气+5%二氧化碳），每2一3d更换一次培养基，取培养4d的单层细胞进行实验。 8.FR损伤模型的制备及分组:取瓶底覆盖有单层心肌细胞的培养瓶若干瓶分为四组:（l）糖尿病单纯缺氧组（DM组），在培养瓶中加人用混合氮气（95%氮气+5%二氧化碳）饱和30min的台氏（介功de’s）液（不含糖）2ml（PO:蕊0.67kPa），同时向瓶中充人混合氮气以置换瓶中剩余的空气，封闭瓶口密闭180min，形成缺氧模型。复氧期则换用混合空气（95%空气+5%二氧化碳）饱和的含15%胎牛血清的DMEMZml（POZ在17.33一20.ookPa之间），并持续向