背景右美托咪定(Dex)做为一个高效、高选择的α2受体激动剂,由于其具有镇痛、镇静、抗炎和利尿等积极作用,同时无明显的呼吸抑制及脑电干扰等副作用,目前在临床中以麻醉辅助用药的身份得到了广泛的应用,在心脏手术中,Dex表现出了能够减少麻醉药物的需要量,增强血液动力学的稳定性和提供心脏手术后患者的镇静作用等方面的优势。随着Dex在心脏手术中的广泛应用,Dex表现出可以降低CPB下心脏手术患者的术后肺损伤和脑损伤的发生率及减轻术后肺损伤和脑损伤的程度。然而,Dex对CPB下心脏手术患者的肾保护作用的安全性和有效性仍存在争议。SugitaS等报道在动物模型中,Dex可减轻大鼠肾缺血再灌注损伤,然而Kari等却报道在临床中Dex仅增加了尿量,并没有对肾脏产生保护作用。心脏直视手术大多需要在体外循环(CPB)辅助下完成,但CPB过程中引起的小栓子脱落、非生理性灌注及炎症反应等可导致肾组织局部产生不同程度的缺血,再灌注被认为是缺血的必要挽救措施,但是随着研究的深入发现缺血后再灌注反而加重原来缺血器官的损伤,所以CPB下心脏手术后,肾脏遭受着缺血及缺血后再灌注等多重打击,最终有可能引起术后不同程度的急性肾损伤(AKI)。肾小管上皮细胞是肾脏主要实质细胞,与其它肾单位相比其最容易发生缺血性损伤,肾H/R损伤很容易导致肾小管上皮细胞凋亡。AKI是一种发病率及死亡率极高和使医疗费明显增加的全球公共卫生问题。临床研究表明CPB下心脏瓣膜置换术是心脏手术后AKI发生的一个独立危险因素。实施合理的肾保护策略具有重要意义,麻醉药物的选择和合理使用是围术期实施肾保护策略的一个重要方面。对于CPB下心脏瓣膜置换术,这一术后高发AKI的手术类型,Dex是否具有肾保护作用,降低术后AKI的发生率尚未见报道。内质网(endoplasmic reticulum,ER):与各种膜蛋白、分泌蛋白、和磷脂胆固醇代谢相关的真核细胞内的最大细胞器,是细胞内折叠蛋白的场所。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS):过度的氧化应激、缺血再灌注和钙离子浓度改变等病理生理改变时均可导致ER功能发生紊乱,细胞对ER功能的需求超过其自身能力,在ER内出现未折叠或错误折叠的蛋白质聚集以及Ca2+稳态失衡的病理状态。适度的ERS是细胞的自我保护性机制,其能够触发哺乳类动物真核细胞内的一种保护性应激反应即未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),最终恢复内质网稳态以使细胞生存;但是过强或过长时间的ERS则可能导致细胞凋亡或坏死,从而造成组织和器官受损。在缺血缺氧、葡萄糖缺乏、钙浓度变化以及氧化应激等病理情况时则能诱发ERS,这是启动细胞凋亡的重要途径之一。研究表明ERS参与心、脑、肾等重要器官缺血再灌注损伤的病理生理过程。但Dex对肾脏的保护作用是否与ERS途径有关尚不清楚。脂质过氧化反应是指机体必须的多不饱和脂肪酸在体内氧化酶的作用下生成了一系列生物活性物质,同时也产生了大量氧自由基。增高的氧自由基不仅可以直接氧化脂质以及蛋白质和DNA等生物大分子,还可以作为信号分子引起细胞内外信号传导通路的异常,导致人体正常细胞和组织的损坏,从而引起多种疾病。围术期肾损伤的发病率不断上升,以缺血再灌注肾损伤最为多见,常发生于肾移植、CPB下心脏手术后、创伤、失血性休克及脓毒血症等疾病基础下,有研究表明肾损伤的发病机制除了与ATP的减少、细胞凋亡基因的调控和细胞内钙超载外,与大量氧自由基的产生也有着密切关系。所以脂质过氧化反应过程中产生的大量氧自由基在缺血性肾损伤的发生发展中具有重要意义,许多减轻肾缺血再灌注的因素亦可以通过抑制脂质过氧化反应而发挥肾保护作用。目前,有关脂质过氧化反应是否参与Dex对肾缺血再灌注的保护作用尚无定论。研究目的本研究分临床试验和细胞实验两部分。第-部分:临床试验部分1.通过给予CPB下瓣膜置换术患者Dex干预后,检测患者各时点的血清中NGAL和尿IL-18的水平,BUN和Cr的浓度,同时记录术中、术后Id和术后2d患者的尿量,诊断并记录患者术后AKI的发生情况,评估Dex对患者肾功能及术后AKI发生率的影响。2.测定患者各时点的血清中MDA浓度和SOD活性,了解脂质过氧化反应是否参与Dex对CPB下瓣膜置换术患者肾功能的影响。第二部分:细胞实验部分1.通过给予肾小管上皮细胞(HK-2细胞)Dex培养后,测定细胞活力及细胞凋亡率,评估Dex对缺氧复氧诱导HK-2细胞凋亡的保护作用2.通过测定经不同培养方式后的HK-2细胞GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表达水平及MDA浓度和SOD活性,探讨ERS和脂质过氧化反应在Dex肾保护作用中的潜在机制。研究方法第一部分:临床试验部分右美托咪定对CPB下瓣膜置换术患者术后急性肾损伤的发生率及肾功能的影响:一项双盲、随机、对照研究择期CPB下心脏瓣膜置换术患者入选了本随机、前瞻性、安慰剂对照和双盲试验。性别不限,年龄18～65岁,ASA分级Ⅱ或Ⅲ级,NYHA分级Ⅱ-Ⅲ级,采用电脑随机数字表法,将其分为两组:对照组(Placebo组)和右美托咪定组(Dex组)。麻醉诱导前Dex组静脉注射4.0μg/ml的右美托咪定0.6 μg/kg(给药时间15 min),随后以0.2μg· kg-1 · h-1速率输注至术毕,Pacebo组给予等容量生理盐水。分别于麻醉诱导前(T1)、手术结束时(T2)及术后12h、24h和72h(T3-5)留取颈内静脉血样和尿液,采用ELISA法测定NGAL和尿IL-18的水平及测定MDA浓度和SOD活性,并测定血清中尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的浓度,同时记录术中、术后1 d和术后2d患者的尿量,记录患者术后急性肾损伤等围术期不良事件的发生情况。第二部分:细胞实验部分内质网应激在右美托咪定对缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用将培养成功的人肾小管上皮细胞系(HK-2细胞),采用随机数字表法,将其分为4组(n=5):正常对照组(C组):置于37℃常氧恒温细胞培养箱28h;右美托咪定组(Dex组):终浓度0.1 nmol/L的Dex孵育2h,随后置于37℃常氧恒温细胞培养箱进行培养28h;缺氧/复氧组(H/R组):置于37℃的厌氧培养罐中缺氧24h后,随后置于37℃常氧恒温细胞培养箱进行复氧4h;Dex+缺氧/复氧组(各Dex+H/R组):用终浓度0.1 nmol/L的Dex孵育2h,随后置于37℃的厌氧培养罐中缺氧24h后置于37℃常氧恒温细胞培养箱进行复氧4h。各组培养结束后采用MTT法检测细胞活力,计算细胞存活率,流式细胞仪检测凋亡率。Western blot法检测GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表达并测定细胞丙二醛(MDA)浓度和超氧化物歧化酶(SOD)活性。实验结果第一部分:临床试验部分最终共有72例患者完成本项试验,两组患者一般资料各指标及术中情况各指标的比较差异无统计学意义(P>0.05)。与T1(麻醉诱导前)比较,两组T5时(术后72h)血清BUN和Cr的浓度升高,T3,4时(术后12h和24h)血清NGAL和尿IL-18的水平升高,T2,3时(手术结束时和术后12h)血清MDA浓度升高,SOD活性降低(P<0.05)。与Placebo组比较,Dex组T5时(术后72h)血清BUN和Cr的浓度降低,T3,4时(术后12h和24h)血清NGAL水平降低(P<0.05),两组各时点尿IL-18水平差异无统计学意义(P>0.05),T2,3时(手术结束时和术后12h)血清MDA浓度降低,SOD活性升高(P<0.05)。与Placebo组比较,Dex组术中尿量增多,术后AKI的发生率明显较Placebo组低(P<0.05)。两组患者术后恢复情况及其他不良事件各指标的比较差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分:细胞实验部分倒置显微镜下,C组和Dex组细胞贴壁良好,形态正常;H/R组活细胞数减少,细胞呈水泡样变性;Dex+H/R组细胞状态较H/R组明显改善。与C组比较,H/R组和Dex+H/R组HK-2细胞活力降低,凋亡率升高(P<0.05);与H/R组比较,Dex+H/R组HK-2细胞活力升高,凋亡率降低,与C组比较,H/R组和Dex+H/R组SOD活性降低,MDA浓度及GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3的表达上调(P<0.05);与H/R组比较,Dex+H/R组SOD活性升高,MDA浓度及GRP78、CHOP、caspase-12和活化caspase-3 的表达下调(P<0.05)。结论第一部分:临床试验部分1.右美托咪定可减轻CPB下心脏瓣膜置换术患者术后肾损伤,降低术后AKI的发生率。2.脂质过氧化反应参与右美托咪定对CPB下心脏瓣膜置换术患者术后肾功能的影响。第二部分:细胞实验部分1.右美托咪定可减轻缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞的凋亡。2.内质网应激通路参与右美托咪定减轻缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞的凋亡。