研究背景:皮肤癌是最常见的恶性肿瘤之一。它大体上可以分为恶性黑素瘤和非黑素瘤性皮肤癌(NMSC),NMSC主要包括鳞状细胞癌(SCC)和基底细胞癌。近年来皮肤癌的发病率呈上升趋势,从而成为了一个全球性的公共卫生问题。SCC主要发生于老年人,50-60岁为发病高峰,男性多于女性,好发于头颈、面部和手背等暴露部位。SCC为起源于表皮或皮肤附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤,常发生于某些皮肤癌前疾病基础上,或由各种癌前疾病演变而来。SCC细胞恶变病因不清,但与以下因素明确相关:(1)紫外线照射;(2)化学致癌因素;(3)癌前病变;(4)瘢痕外伤和其他慢性皮肤病;(5)免疫抑制。其中紫外线照射是皮肤癌发生的主要原因。流行病学数据表明,在发展到恶性肿瘤发生之前往往需要累积紫外线过度照射几年或几十年。保护人体皮肤免受紫外线辐射的最重要的防御机制涉及黑色素的合成,并积极修复机制。SCC在组织病理学上表现为侵袭性生长,自表皮向下突破基底层侵入真皮,呈条索状和不规则团块状,由正常鳞状细胞和非典型鳞状细胞组成。前者分化好,可形成角质形成细胞,后者分化不好,即所谓癌细胞。向角化方向分化的癌细胞内常见角珠及角化不良细胞。已分化的鳞状细胞可见细胞间桥。未分化和低分化的鳞状细胞体积较小,无细胞间桥和角化不良细胞。Broders根据未分化癌细胞所占百分比,结合癌细胞的非典型程度与损害的侵袭程度将SCC分为4级。Ⅰ级SCC(即高分化鳞癌):SCC内含低于25%非典型鳞状细胞,向下侵犯真皮但不超过真皮中部汗腺水平,SCC团块中角珠多见,中心可完全或部分角化,边缘断续可见基底层细胞,与周围间质无明显分界,SCC周围真皮内有明显炎症反应,一般不发生转移。Ⅱ级SCC: SCC内含25%-50%非典型鳞状细胞,向下侵犯至真皮深处,SCC团块中角珠少见,中心角化程度轻、多见角化不全,与周围间质无明显分界,SCC周围真皮内炎症反应轻。Ⅲ级SCC: SCC内含50%～70%非典型鳞状细胞,SCC团块中不见角珠,中心角化程不明显,细胞核不典型,有丝分裂象显著,SCC周围真皮内炎症反应不明显。Ⅳ级Scc(即低分化鳞癌):SCC内几乎均为非典型鳞状细胞,SCC团块中无细胞间桥,,中心无角化,有丝分裂象多,当呈梭形的癌细胞呈旋涡状排列时与肉瘤难以鉴别。SCC的标准治疗包括手术、放射治疗和化学药物治疗。然而经过上述治疗的患者在2年内仍然可能复发和远处转移。鉴于在肿瘤治疗过程中基因疗法的快速进展和单一基因治疗的低稳定性和有效性,以及先前研究所表明的携带有两个或者两个以上基因的重组腺病毒对多发性骨髓瘤以及喉癌等多个肿瘤具有细胞毒性,因而需要一个具有高的稳定性和有效性的联合基因治疗方法来进一步改善SCC患者的预后。在本课题中我们重点研究了与人类重组野生型p53基因相关的N-myc下游调节基因2 (NDRG2)以及鼠双倍突变体2 (MDM2)的单独以及联合应用对SCC的作用。p53是一个著名的抑癌基因,p53信号通路是肿瘤发生中最常见的突变通路。当发生DNA损伤和各种细胞毒性时,p53就会诱导受损细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡。p53不仅在肿瘤抑制中起着重要作用,它还是一个广泛的转录因子。它调节着2500多种基因,其中绝大部分的基因都与肿瘤的发生、发展和侵袭有关。治疗被引进,作为其引起凋亡的结果,在数个临床试验中表现出了对肿瘤细胞内在的致死性作用,这为控制肿瘤打开了一道新的大门NDRG2为p53基因的靶基因,且可不依赖p53基因单独起作用。NDRG2属于NDRG家族的一员。它与ABH超家族具有显著的结构相似性。它含有两个亚型。主要的氨基酸序列信息表明:这两种NDRG2蛋白都显示了与ABH超家族显著地结构相似性。NDRG2通过调节不同的细胞因子在细胞应急反应、细胞分化、增殖、凋亡等许多生物过程中扮演抗增殖、抗侵袭、促凋亡等多重角色。在多种肿瘤细胞中NDRG2的表达减少或缺失。另外,多种恶性肿瘤的预后与肿瘤表达NDRG2呈负相关。近些年来,许多体内和体外研究表明NDRG2在很多肿瘤细胞中引起细胞凋亡,具有抗增殖和防扩散作用。NDRG2是P53的一个新的靶基因,参与了细胞中的DNA损伤反应,并且在P53介导的细胞凋亡中发挥着重要作用,同时又是一个可以增强肿瘤细胞化疗敏感性的新基因。在本次研究中,我们在体外SCC-13细胞系以及SCC裸鼠模型中,探索了携带siMDM2和NDRG2基因的重组腺病毒对肿瘤体积退化的影响。鼠双倍突变体2 (MDM2)是一个原癌基因,已在多种肿瘤中发现其突变与扩增,mdm2扩增与肿瘤转移密切相关。mdm2基因最初是从一个含有双微体(murinedoubleminute,MDM)的自发转化的BALB/3T3DM细胞中克隆出来的一个高度扩增的基因,此基因位于小鼠的第10号染色体的C1-C3区,1992年Momand等人首次分离和证明了大鼠的mdm2基因产物是一种分子为90000Da的蛋白质。野生型p53诱导MDM2的表达,反过来,MDM2通过促进野生型p53的降解以及抑制其转录活性来形成一个负反馈环。MDM2通过负调控p53的转录活性,介导细胞阻滞和细胞凋亡,促进肿瘤形成,从而参与了许多人类癌症的发生。MDM2的超表达对抗p53基因疗法对肿瘤的治疗。从而,对p53-MDM2反馈回路进行干扰,就为恢复p53肿瘤抑制活性,提供了一条新的抗肿瘤策略。MDM2是一种E3泛素连接酶,也是p53通路的重要调节者。它以两种方式负调节p53: 一种是通过直接结合来抑制转录;另一种是通过它的E3连接酶活性来降解p53蛋白。ARF直接结合MDM2然后抑制E3泛素酶的活性来调节p53的转录活性。肿瘤细胞中,通过腺病毒介导的p53基因治疗来提高野生型p53表达的增加,是一种可能的克服p53基因突变的治疗方法。Lang等在临床试验中发现:瘤内注射含p53的腺病毒载体都导致了 p53基因的转录和功能性外源性p53的表达。因此,通过特定小干扰RNA (siRNA)技术直接下调MDM2表达对治疗具有P53基因表达的皮肤癌或许是一个有效的方法。目的:研究不同重组腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因疗法对SCC细胞系及荷瘤小鼠模型的治疗作用,以期为临床找到更有效的治疗SCC的方法。方法:(1)委托汉恒生物科技构建重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2,利用293A细胞进行病毒繁殖、纯化,得到足够剂量和浓度的基因治疗试验用病毒。(2)对购买的SCC-13细胞系进行复苏、增殖、传代等体外培养,并进行重组腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 转染实验。(3)建立荷瘤小鼠模型,皮下注射0.9%NaCl、重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2治疗,观察各组小鼠肿瘤体积大小。(4)利用CCK-8试剂盒检测重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2感染SCC-13细胞系后SCC-13细胞的增殖潜力。(5)利用RT-PCR和Western blot从基因和蛋白质水平分别研究MDM2、NDRG2基因在重组腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 感染的SCC-13细胞系内的mRNA表达变化以及相应蛋白产物的变化,尤其是从SCC-13细胞caspase3蛋白表达水平进一步研究重组腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治疗引起SCC-13细胞凋亡的机制。(6) Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测分析评估荷瘤小鼠SCC-13细胞凋亡率。(7)利用 MTT 研究重组腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2转染SCC-13细胞后不同时间点SCC-13细胞的细胞毒效应。结果:(1)实验获得了足够剂量和浓度的试验用SCC-13细胞及重组腺病毒。(2) SCC-13 细胞能够被重组腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2高度有效转染,在转染后48h检测到GFP的表达。且在MOI为100时感染效率最好。(3)皮下注射重组腺病毒 0.9%NaCl、Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2各组小鼠肿瘤体积比较显示:0.9%NaCl和Ad-GFP组平均肿瘤体积最大,Ad-siMDM2、Ad-NDRG2组平均肿瘤体积相近,Ad-siMDM2-NDRG2组平均肿瘤体积最小。(4)在 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 转染的 SCC-13 细胞内,与 Ad-GFP 组相比,Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 组对 SCC-13细胞增殖具有明显的抑制。(5)在基因水平的RT-PCR研究结果显示:①与对照组相比,重组腺病毒Ad-siMDM2、Ad-siMDM2-NDRG2 转染的 SCC-13 细胞内 MDM2 基因的 mRNA 表达显著减少;②SCC-13细胞内本身NDRG2基因表达水平较低,但在重组腺病毒Ad- NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2转染的SCC-13细胞内,NDRG2的超表达相应增加了其 mRNA 的表达。重组腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治疗可促进SCC-13 caspase3蛋白表达。在蛋白质水平的Western blot研究结果,验证了上述基因研究结果。(6)对荷瘤小鼠瘤细胞进行的Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测分析结果显示:MDM2基因沉默和NDRG2基因超表达显著引起小鼠肿瘤细胞的凋亡。(7) MTT研究SCC-13细胞毒性效应结果显示:Ad-siMDM2-NDRG2组与Ad-GFP组相比较,P<0.05;同样 Ad-siMDM2-NDRG2 组与 Ad-siMDM2 组和 Ad-NDRG2 组相比较P<0.05。结论:重组腺病毒Ad-siMDM2-NDRG2联合基因治疗比单一 Ad-siMDM2或Ad-NDRG2基因治疗能更有效的感染SCC,可为SCC的临床治疗提供一个潜在的有效手段。