【摘 要】
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基因组DNA的遗传稳定性是维持正常的细胞复制、增殖和分化的关键。外源因素和内源因素造成的DNA损伤及其修复失败,是各种遗传疾病发生的根本原因。其中,内源因素包括DNA复制错
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基因组DNA的遗传稳定性是维持正常的细胞复制、增殖和分化的关键。外源因素和内源因素造成的DNA损伤及其修复失败,是各种遗传疾病发生的根本原因。其中,内源因素包括DNA复制错误、细胞代谢活动产生的化学物质(如自由基)。外源因素包括紫外线、放射线、药物和病毒等。目前认为,DNA损伤应答与修复是一个涉及多种相关基因精细调节的复杂过程,研究这些相关基因在此过程中的机制和特性,对于阐明DNA损伤与疾病发生的关系具有重要意义。
SPATA12基因(Spermatogenesis Associated Gene12,SPATA12)是一个精子发生相关基因,主要定位于初级精母细胞和精子细胞中。在人类染色体上,SPA TA12定位于一个重要的抑癌基因侯选区域3p14。我们前期的研究工作发现,SPATA12可能作为抑制因子在精子发生或肿瘤发生中起作用。通过酵母双杂交技术,我们课题组筛选到一个与SPATA12相互作用的蛋白CHD2。已知CHD2是一个染色质重塑因子,可以通过影响p53的转录活性来参与DNA损伤应答途径的后期阶段反应。基于以上研究背景,本论文主要探讨了SPATA12与CHD2的关系以及SPA TA12在DNA损伤中的作用及其机制。研究工作主要包括以下三个方面:
1.SPATA12与CHD2相互作用的确定
通过分别构建SPATA12-EGFP融合荧光蛋白和CHD2-DsRed融合荧光蛋白,利用基因转染和激光共聚焦技术,共定位实验显示CHD2与SPATA12共同定位于细胞核,在空间上具备相互作用的基础;通过双分子荧光互补技术证实了二者在核内相互结合的真实性。
2.紫外UV-C诱导的细胞DNA损伤模型的建立
通过MTT、PI双染、流式细胞术以及单细胞凝胶电泳技术,分别从细胞行为与功能、DNA结构完整性等方面进行综合分析,成功建立了一个合适的紫外(UV-C)诱导的DNA损伤模型。
3.SPATA12应答DNA损伤反应的作用及机制
通过RT-PCR和Western bloting实验我们发现,在Hela和MCF-7细胞中,SPATA12能够被UV-C诱导而重新表达。通过克隆形成、细胞划痕和宿主活细胞再活化实验,发现在UV-C诱导的DNA损伤中,外源表达的SPATA12能够抑制细胞增殖和克隆形成率。通过双荧光素酶报告基因分析系统和AP-1 decoy ODNs技术,从正反两个方面证实了SPATA12可通过其启动子区域的AP-1结合位点来实现对UV-C损伤的应答。进而,我们将SPATA12基因分别转染H1299细胞(p53null)、Hela细胞(p53 functional deletion)和MCF-7细胞(p53 WT)中,进行流式细胞仪分析,结果提示SPA TA12在应答UV-C诱导DNA损伤的过程中,其对细胞增殖的抑制作用可能是p53依赖性的。更重要的是,我们发现外源表达SPATA12能够促进p53的表达,显示SPATA12可能通过促进p53的表达来阻滞细胞周期进程。
综上,我们证实了SPATA12与CHD2能够在细胞核内相互作用;在UV-C诱导的DNA损伤过程中,SPA TA12以p53依赖的方式,通过其启动子区域的AP-1结合位点来响应损伤信号。
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