近年来,随着经济水平的飞速发展和人们生活方式的转变,许多新发传染病越来越多呈现出“人兽共患”的模式。人兽共患病流行速度快,传播途径多,传播范围广,不仅会给农牧业造成巨大的经济损失,也会对人群健康带来严重威胁。许多人兽共患病并不是由单一病原体引起,而是由两种甚至多种病原体引起,缺乏特异性的临床表现,给临床诊断和治疗带来了很大的难度。所以,加强对人兽共患病的监控对于降低人兽共患病带来的危害十分重要。目前对人兽共患病病原菌的检测方法主要有传统分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法,这些方法在使用时均存在一定程度的不足,如检测时间长、步骤繁琐、对实验室和操作人员要求较高,或不能实现多种病原菌的同步检测等。因此,寻求操作简单、快速、准确的多种病原菌同步检测的新方法,对于预防和控制人兽共患病、减少其带来的经济损失和医疗负担具有非常重要的意义。本研究选择常见且高发的三种人兽共患病病原菌大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌作为目标病原菌,利用卵黄抗体技术制备能够同时识别这三种病原菌的三价卵黄抗体,将其与羧基磁珠偶联制备免疫磁珠,利用磁分离技术实现对待测样品中三种病原菌的快速富集与分离;同时利用多克隆抗体制备技术制备大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌的兔多克隆抗体,以及实验室前期制备的布鲁氏菌兔多克隆抗体,将三种兔多克隆抗体分别与三种具有不同荧光发射波长的Cd Se/Zn S量子点偶联,制备三种量子点荧光生物探针,分别用于标记三种目的病原菌,最终建立一种基于免疫磁分离技术和量子点荧光标记技术的三种病原菌同步、快速、准确检测的新方法。本课题的主要研究内容包括以下四个部分:第一部分三价卵黄抗体的制备及鉴定(1)按照菌悬液浓度1:1:1的比例制备大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌的三价灭活疫苗,免疫健康高产蛋鸡,收集鸡蛋,采用PEG 6000沉淀法提取三价卵黄抗体。(2)优化间接ELISA法反应条件,采用间接ELISA法对免疫后蛋鸡血清及所提取的三价卵黄抗体的效价进行测定。结果表明,随着免疫时间的延长,血清及三价卵黄抗体的效价呈明显的升高趋势,在初次免疫后第6周时血清中已产生了较高抗体效价的三价抗血清,在初次免疫后第10周三价卵黄抗体对大肠杆菌O157:H7和布鲁氏菌的抗体效价达到最高,第12周时对单增李斯特菌的抗体效价达到了最高。(3)采用BCA蛋白定量试剂盒测定三价卵黄抗体的蛋白含量。结果表明,所提取的三价卵黄抗体的蛋白含量范围为5.73~21.03 mg·m L-1,其中第10周所提取的三价Ig Y的蛋白含量最高,为21.03 mg·m L-1。(4)采用间接ELISA法对三价卵黄抗体的特异性进行鉴定。结果表明,所制备的三价卵黄抗体仅与副溶血弧菌出现了交叉反应,与其他九种菌株均没有出现交叉反应,特异性较好;采用SDS-PAGE电泳检测卵黄抗体的纯度,可以观察到明显的重链条带和轻链条带,纯度较高。第二部分兔多克隆抗体的制备及鉴定(1)分别制备大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌的灭活疫苗,免疫健康新西兰大白兔,收集抗血清,采用饱和硫酸铵沉淀法提取兔多克隆抗体。优化抗体检测的间接ELISA方法,并对抗体效价进行测定。结果表明,随着免疫时间的延长,血清抗体效价逐渐升高,大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体血清效价在第四次加强免疫后10天达到1:256000,单增李斯特菌兔多克隆抗体血清效价在第四次加强免疫时达到1:256000。在第四次加强免疫后10天,采血收集抗血清,采用饱和硫酸铵沉淀法提取两种兔多克隆抗体,所提取的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体效价达到1:128000,单增李斯特菌兔多克隆抗体效价达到1:512000。(2)采用间接ELISA法对两种兔多克隆抗体的特异性进行鉴定,结果表明所制备的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体与金黄色葡萄球菌、鲍氏志贺氏菌和粘质沙雷氏菌出现了交叉反应,与其他菌没有出现交叉反应,特异性良好;所制备的单增李斯特菌多克隆抗体与金黄色葡萄球菌、粪链球菌和粘质沙雷氏菌出现了交叉反应,与其他菌没有交叉反应,特异性良好。(3)采用BCA蛋白定量试剂盒测定两种兔多克隆抗体的蛋白含量,所提取的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的蛋白含量为29.06 mg·m L-1,所提取的单增李斯特菌多克隆抗体的蛋白含量为38.27mg·m L-1;采用SDS-PAGE电泳检测两种多克隆抗体的纯度,可以观察到明显的重链条带和轻链条带,纯度较高。第三部分量子点荧光生物探针的制备及表征(1)采用有机相合成法制备三种具有不同荧光发射波长的Cd Se/Zn S量子点。采用巯基丙酸作为稳定剂,将Cd Se/Zn S量子点转入水相,通过透射电镜、荧光光谱和紫外光谱对合成的三种Cd Se/Zn S量子点进行表征,结果显示,所合成的三种Cd Se/Zn S量子点的荧光发射波长分别为539 nm、583 nm和634 nm,形状近似球形,粒径均一,分散性好。(2)采用EDC和NHS作为偶联剂,将三种不同发射波长的荧光量子点分别与大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体、单增李斯特菌兔多克隆抗体和布鲁氏菌兔多克隆抗体进行偶联,制备了三种量子点荧光生物探针,通过红外光谱、Zeta电位和荧光光谱等进行表征。红外结果显示,量子点的红外谱图发生了改变,在1550 cm-1附近出现了一组肽键官能团(-NH-CO-)的特征吸收谱带;Zeta电位结果显示,偶联多克隆抗体后的量子点表面电位向正电荷方向移动;荧光光谱结果显示,三个荧光发射峰峰形对称,位置上相互分离,说明成功制备了三种量子点荧光生物探针。第四部分三种人兽共患病病原菌同步快速检测方法的建立及效果评价(1)采用EDC和NHS作为偶联剂,将羧基磁珠与三价卵黄进行偶联制备可同时识别三种病原菌的免疫磁珠,通过红外光谱、Zeta电位和DLS等方法进行表征,红外光谱显示,偶联卵黄抗体后磁珠表面出现了肽键官能团(-NH-CO-)的特征吸收谱带,Zeta电位结果显示,偶联三价卵黄抗体后的磁珠表面电位向正电荷方向移动,DLS结果显示,偶联卵黄抗体后磁珠的粒径增加,以上表征结果说明三价卵黄抗体被成功偶联于羧基磁珠表面。(2)采用所制备的免疫磁珠对待测样品中大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌三种目标病原菌进行捕获与快速分离,采用三种不同荧光发射波长的量子点荧光生物探针进行目标病原菌的检测,对检测过程中的反应条件进行优化。结果显示,免疫磁珠的最佳用量为50μL,富集时间为60 min,三种量子点荧光生物探针的最佳用量均为200μL,量子点标记时间为60 min,忽略磁分离洗涤时间,整个检测程序需要120 min。(3)对建立的基于免疫磁分离技术和量子点荧光标记技术的三种病原菌同步快速检测方法的检测效果进行评价,结果显示,该方法检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌的最低检测限分别为103 CFU·m L-1、103 CFU·m L-1和104 CFU·m L-1;采用加标回收实验检测方法的准确度,对三种病原菌的加标回收率均处于90%~110%,准确度良好;重复性实验结果显示,该检测方法对三种病原菌检测的变异系数均低于10%,说明方法的稳定性较好;特异性实验结果显示,所建立的检测方法对副溶血弧菌和粘质沙雷氏菌检测特异性较差,对其他菌株检测特异性较好。(4)采用建立的基于免疫磁分离技术和量子点荧光标记技术的三种病原菌同步快速检测方法对牛奶、羊肉和白菜样品进行检测,当待测样品为牛奶样品时,大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌三种病原菌的最低检出限均为103 CFU·m L-1;当待测样品为羊肉样品时,大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌三种病原菌的最低检出限分别为104 CFU·m L-1、103 CFU·m L-1和104 CFU·m L-1;当待测样品为白菜样品时,大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌三种病原菌的最低检出限分别为103 CFU·m L-1、104 CFU·m L-1和105 CFU·m L-1。综上,本研究采用卵黄抗体技术、多克隆抗体技术、免疫磁分离技术和量子点荧光标记技术建立的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和布鲁氏菌同步检测方法。该方法特异性好、灵敏度高、重复性和稳定性好、检测时间短,能够用于三种病原菌的同步快速定量检测,为进一步开发多种人兽共患病病原菌同步、快速准确的检测试剂盒奠定了基础。