研究背景：细胞衰老是抵御癌症的重要屏障,在抑制肿瘤发生过程中具有重要的作用。细胞衰老可以避免损伤在细胞内的积累,消除形成肿瘤的潜在威胁。同时,细胞衰老也往往被看作是引发癌症的一个诱因。正常组织中含有恒定数量的细胞,衰老细胞的增多会破坏组织自身的更新和修复,进而改变细胞的微环境,影响组织的结构和功能,有利于细胞肿瘤化。因此,衰老是一把双刃剑,对其深入研究,对延缓衰老和治疗肿瘤具有重要意义。为了研究衰老与肿瘤之间关系,早期实验我们建立了Werner综合症(Werner syndrome,WS)小鼠模型。该小鼠模型忠实再现了人类早老综合症,肿瘤易感等症状。由于这种小鼠模型是端粒酶敲除的,所以其产生的肿瘤是端粒酶阴性的,使用端粒延长替代机制(Alternative Lengthening of Telomere, ALT)维持细胞增殖的肿瘤。该小鼠模型具有提早衰老和肿瘤易感的特性,使其成为研究衰老与肿瘤辩证关系的一个有力工具。早期研究发现Wrn早老综合症小鼠的MEF(G5)细胞具有提早衰老的现象,但是其中些细胞逃逸衰老,形成永生化细胞系(395-3B-1、395-3B-2、395-9B-1、395-6B-1、395-7A-1、395-7A-3),而其中有有一些细胞(395-3B-1、395-3B-2、395-9B-1)能够在SCID小鼠体内形成肿瘤,称之为ALT肿瘤细胞。此外,在分子水平研究发现,这些ALT肿瘤细胞中p16基因的启动子区域CpG岛是高度甲基化,然而,当这些细胞过表达外源的p21后,其p16基因发生去甲基化的现象。相关研究表明,组蛋白的一些氨基酸经过一些修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化后,会影响染色质的结构以及DNA甲基化,进而调节基因的表达。此外,相关研究显示：miRNAs可以调控DNMTs的表达活性,间接影响下游靶基因启动子的甲基化水平以及表达活性,并参与疾病的发生发展。因此,深入研究p21诱导p16化的机制对肿瘤以及相关疾病的治疗具有一定的意义。目的：探究p21诱导p16基因启动子区域CpG岛去甲基化的机制。研究方法：通过Real—Time PCR和Western—Blot技术检测ALT肿瘤细胞395-3B-2细胞过表达外源p21前后,细胞中相关基因和蛋白的表达变化并通过BSP技术检测p16甲基化状态,以验证前期实验现象发生的真实性。此外,在此基础上,利用Real—Time PCR技术检测,过表达p21后,细胞中相关miRNAs表达变化,以验证此现象的发生与miRNA相关。因此,我们利用RNAi技术,构建得Dicer-RNAi干扰载体并转染395-3B-2细胞,验证miRNAs参与。研究结果：前期实验通过染色质免疫共沉淀技术和免疫印迹技术发现p16启动子区的组蛋白修饰改变,转录抑制的组蛋白修饰减少,转录激活的组蛋白修饰增多,多梳蛋白家族中的重要成员Ezh2和Bmi-1显著降低。DNMT1的转录共激活因子p300的蛋白表达降低,推测p21可能通过降低p300来降低DNMT1的转录。本实验研究发现ALT肿瘤细胞395-3B-2过表达外源p21后,细胞中DNMT1表达降低,进而引起p16去甲基化。参与DNMT1表达调控的miRNAs表达检测发现,miR-152和miR-185表达上调,反补实验证明,miR-185和miR-152参与调控。然而,在研究通过敲低Dicer抑制miRNAs参与调控的过程中,我们发现,Dicer敲低可以促使p-AKT表达上调,免疫荧光实验证实p21主要在细胞质中表达,推测p21蛋白被磷酸化进入细胞核受阻。那么,p21是通过调控miRNAs,使p16去甲基化,还是直接进入细胞核作用于p16而使其去甲基化的?证据不足。因此,通过敲低Dicer,验证miRNAs参与p21诱导p16去甲基化的实验思路,由于证据不足,不足于说明miRNAs参与调控。此外,Dicer实验过程中发现,Dicer敲低在某种程度上可以使细胞恶性程度增加,相关研究表明MCF-7细胞Dicer敲低后,细胞增殖能力增强且细胞周期加快,皮下注射SCID小鼠可以形成肿瘤,但本实验未能观察到肿瘤形成。研究结论：综上所述,ALT肿瘤细胞中过表达外源p21后,p300表达下调进而导致DNMT1表达下调,诱导p16启动子区域发生去甲基化。此外,过表达p21导致细胞中miR-152和miR-185表达升高,而miR-152和miR-185可以直接作用于DNMT1的3’UTR,抑制DNMT1表达,从而使p16启动子区域发生去甲基化。Dicer敲低引起p-AKT激活而表达上调,免疫荧光实验证实p21主要在细胞质中表达,推测p21蛋白被磷酸化而不能进入细胞核,p16甲基化状态不变。