白粉病菌诱导小偃麦异附加系SN6306差异表达基因的克隆与功能分析

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小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麦专化型Blumeria graminis f. sp. tritici(Bgt)引起的气传性病害。在我国,自从上世纪90年代初两次白粉病大流行后,小麦白粉病的发病面积都处在较高的水平上,已成为小麦高产、稳产的重要限制因素之一。由于在较短时间内小麦白粉病菌就能突变成新的生理小种并且含单一抗性基因品种会在短期内抗性减弱甚至丧失,因此发掘与利用新的抗病基因、培育具多抗病基因聚合的并持久抗病的品种具重要意义。本研究以高感白粉病菌生理小种E09小麦品种YN15及其与中间偃麦草的杂交后代高抗白粉病菌生理小种E09小偃麦异附加系SN6306为研究对象,采用GeneFishing-PCR与RNA-seq技术对小麦白粉病菌E09诱导后的SN6306与YN15中的差异表达基因进行筛选。主要结果如下:(1)GeneFishing-PCR技术筛选差异基因利用GeneFishing-PCR对SN6306与YN15白粉菌诱导前后的cDNA序列进行筛选,选取SN6306在白粉菌诱导后上调表达的差异条带进行克隆测序,得到与基础代谢(38.6%)、信号转导(1.6%)、转录翻译(11.8%)、蛋白合成(5.5%)、抗生物胁迫(11.8%)及抗非生物胁迫(11.0%)有关的127个EST序列。(2)小麦TaARP1基因的克隆及功能初步分析在GeneFishing-PCR获得的SN6306在白粉菌诱导后上调表达结果中,经过分析得到69B1为编码TaARP1的序列,经PCR扩增得到长度分别为751bp的cDNA与1072bp的DNA序列,含有长度为181bp和140bp的两个内含子区,开放阅读框为348bp,编码115个氨基酸残基。TaARP1与大麦、粗山羊草、短柄草等单子叶植物中的ARPs相似,进化上同源。qRT-PCR结果显示,该基因在白粉菌诱导后比未诱导对照上调表达了约10倍。BSMV-VIGS结果显示,该基因的短暂沉默,白粉病菌侵染后的小麦叶片的病斑比未沉默的对照叶片的病斑大,说明其可能在响应白粉病菌的过程中起作用。(3)小麦TaTGA4基因的克隆及生物信息学分析在GeneFishing-PCR获得的SN6306在白粉菌诱导后上调表达结果中,经过分析得到36113为编码TaTGA4的序列,经PCR扩增得到长度为1444bp的cDNA序列,预测编码区长度为1221bp,编码含有406个氨基酸残基的蛋白。该蛋白含有b_ZIP1superfamily与DOG1superfamily保守结构域,与节节麦(Aegilops tauschii)TGA4的一致性(identities)达到92%,与乌拉尔图小麦(Triticum urartu)TGA4的一致性(identities)达到90%。多序列联配及系统发育分析得出小麦与节节麦和乌拉尔图小麦的亲缘关系较近,进化上有一定的同源关系。(4)RNA-seq技术筛选差异基因对白粉菌诱导后SN6306与YN15不同时间点各自的混合样品进行转录组测序。首先,选取在YN15中读数为0(Read B=0)的7个差异表达基因序列进行普通PCR扩增,扩增的测序结果与RNA-seq测序的结果一致,可以确信RNA-seq序列的准确性,而且以基因组DNA为模板的扩增表明,有6条序列在SN6306及中间偃麦草中获得了扩增产物且序列高度相似。其次选取YN15中读数约为0(Read B≈0)的39个差异表达基因在白粉病菌诱导下的表达情况进行分析。这39个差异表达基因在YN15中的表达量基本没有或者很少,而在SN6306中表达,推测这些基因很有可能来源于其亲本中间偃麦草。其中12个基因表现出白粉病诱导后上调表达的趋势,上调表达量是对照的3倍至45倍不等。这些上调表达的基因编码的产物中,主要是蛋白酶以及信号转导蛋白,包含内部柯巴基二磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase, ent-CPS)、猪笼草天冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteinase nepenthesin)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-proteinkinase)等。
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