酶是一种对底物具有高度特异性的高性能生物催化剂,参与生物体内的各种反应,与生物体的体内平衡、生长发育以及个体繁殖等生命活动紧密相关。因此,酶作为一类非常重要的药物靶点,其抑制剂筛选可为新药开发提供参考。从天然产物中寻找安全有效的酶抑制活性成分是当前新药研发的重要方向之一,而传统的游离酶活性测定方法存在操作周期较长和耗时费力等缺点。因此,采用多种固定材料和方法进行酶的固定化,建立简单、有效和高通量的筛选方法可为从天然产物中发掘有效的酶抑制活性成分提供方法参考。另一方面,由于酶的催化具有高效性、特异性、可调节性和简单性的特点,使其在分析检测领域特别是在传感检测方面具有重要的应用。便携式血糖仪和纸基传感器具有价格低廉、便携、样品用量少和操作简单等特点而被广泛应用于即时检测（POCT）领域。目前,传统的便携式血糖仪多用于血糖的测定;纸基检测平台主要依赖于光、电化学信号等进行检测,定量分析往往涉及到复杂的仪器设备而限制了其在偏远地区的广泛应用。因此,本文基于酶的催化反应,建立便携式血糖仪和肉眼可读的纸基定量检测方法对于拓展便携式血糖仪的应用以及在偏远地区和紧急公共卫生事件发生后对目标分析物的快速有效的识别和测定具有实际应用价值。本论文主要包括十一个章节,其中九个章节为实验研究内容。第一章为绪论部分。首先简要介绍了酶的分类、催化作用及反应动力学基本理论知识,以及不同计算模型推算酶催化反应动力学参数Km和Vmax的方法及其优缺点。其次,分别以游离酶和固定化酶作为靶标,结合当前各种分析技术从中药及天然产物中筛选酶抑制剂的研究进展进行了综述,并对其中的固定化酶技术进行了介绍。另一方面,对POCT技术包括便携式血糖仪、便携式纸基传感器、微流控芯片、电化学纸基芯片、pH计、温度计和压力计在分析检测中的应用进展进行了综述。第二章研究中采用酪氨酸酶（TYR）介导的多巴胺聚合和内部释放Ca2+方法实现聚多巴胺-海藻酸钠磁珠对TYR和β-葡萄糖苷酶（β-Glu）双酶的包埋,并考察比较了温度和pH值对游离酶和固定化酶催化活性的影响。在最佳的酶促反应条件下,分别利用左旋多巴和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p NPG）作为TYR和β-Glu的底物,测得的固定化TYR和β-Glu的Km值分别为2.72 m M和3.45 m M,阳性药曲酸和栗精胺对固定化TYR和β-Glu的IC50值分别为13.04μM和56.23μM。最后,将固定化双酶用于茶多酚提取物的酶抑制活性评价。结果发现红茶和白茶中提取的茶多酚对TYR的抑制作用较强,而从红茶和黑茶中提取的茶多酚对β-Glu显示出较好的抑制活性。本章研究为固定化多酶的支撑材料开发以及固定方法提供了参考。第三章研究中采用磁性二氧化硅材料结合Con A亲和固定技术定向固定凝血因子Xa（FXa）,并考察比较了温度和pH值对游离酶和固定化酶催化活性的影响。在优化的条件下测得的游离和定向固定化FXa的Km值分别为0.17 m M和0.10m M,阳性药利伐沙班对固定化FXa的IC50值为0.35μM。进一步利用该方法从天然产物小分子化合物中筛选潜在的直接FXa抑制剂。结果发现表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）具有较好的抑制活性。最后,分子对接研究表明EGCG、GCG、ECG、隐绿原酸和FXa之间主要是疏水、静电和氢键相互作用。本章研究为定向固定化酶的载体材料开发以及固定方法提供了参考。此外,所建立的抑制剂活性评价方法可为天然产物中FXa抑制剂筛选提供有效手段。第四章研究中采用简便、快速和自动化的方法将胰蛋白酶物理吸附到毛细管内表面开发一种基于毛细管电泳（CE）的固定化胰蛋白酶微反应器（IMER）。以Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物,在优化的条件下测得的固定化胰蛋白酶的Km值为0.99 m M。然后,以市售的胰蛋白酶抑制剂苯甲脒作为阳性药以验证基于CE的胰蛋白酶IMER用于酶抑制剂筛选的可行性,并测定其IC50和Ki值,结果分别为3.39 m M和1.68 m M。同时,采用所建立的方法评价了六个常见酚酸包括芥子酸、阿魏酸、没食子酸、咖啡酸、肉桂酸和香草酸对胰蛋白酶的抑制作用。结果发现阿魏酸、没食子酸和咖啡酸在浓度为0.15 m M时表现出较好的酶抑制活性。最后,分子对接研究结果表明酚酸可以通过非竞争性模式改变酶的结构来抑制该酶的活性。本章研究为在线评价功能性食品中酚酸对胰蛋白酶抑制活性提供高效快速的方法,测定结果有助于促进酚酸在功能性食品中的合理应用。第五章研究中利用聚多巴胺涂层较强的黏附性和良好的生物相容性,建立了一种有效而简单的固定化胰蛋白酶CE-IMER。首次以S-2765（分子式:Z-D-Arg-Gly-Arg-p NA·2HCl）作为发色底物在线测定固定化胰蛋白酶的酶学性质,在优化的条件下测得的固定化胰蛋白酶的Km值为0.47±0.08 m M。以市售的胰蛋白酶抑制剂苯甲脒作为阳性化合物并测定其IC50值和Ki值,结果分别为3.34 m M和3.00 m M。采用所建立的方法评价了四个儿茶素类小分子化合物和三种茶多酚提取物的酶抑制活性。结果发现,EGCG和ECG,以及绿茶、白茶和红茶提取物具有较好的酶抑制活性。最后,分子对接研究表明EGCG、ECG、EC和EGC不仅位于酶催化腔中,而且位于酶-底物结合口袋中。本章研究建立了一种有效的评价儿茶素对胰蛋白酶抑制活性的方法,测定结果有助于阐释饮茶对消化系统酶活性的影响,促进其在功能性食品和饮料中的应用。第六章研究中利用β-葡萄糖苷酶（β-Glu）水解底物D（-）-水杨苷产生葡萄糖,葡萄糖又与血糖试纸上葡萄糖脱氢酶反应产生血糖仪可检测的信号,建立了一种快速测定β-Glu及其抑制剂筛选的血糖仪方法。在优化的条件下利用该方法实现β-Glu的定量检测,线性范围为1.0–9.0 U/m L,检测限为0.45 U/m L,测得苦杏仁提取物中β-Glu的回收率分别为96.2%和84.3%。以市售的β-Glu抑制剂栗精胺作为阳性化合物并测定其IC50值为4.81μM。进一步利用所建立的血糖仪方法评价了十四个小分子化合物和六种茶多酚提取物的酶抑制活性。结果发现,没食子酸、原儿茶醛、隐绿原酸、EC、EGC和香草酸对β-Glu具有良好的抑制作用（均高于40%）。最后应用分子对接技术预测了单体化合物与酶的结合能以及可能的活性结合位点。结果发现,没食子酸、原儿茶醛、隐绿原酸、EC、EGC和香草酸都位于β-Glu的活性位点口袋中。本研究基于血糖仪的双酶级联反应检测非葡萄糖物质,一方面拓展了血糖仪的应用,另一方面为β-Glu的测定及其抑制剂筛选提供了简便高效的方法。第七章研究中利用碱性磷酸酶（ALP）水解底物氨磷汀生成具有电化学活性的产物WR-1065,WR-1065与血糖试纸上媒介K3[Fe（CN）6]反应产生血糖仪可检测的信号,建立了快速测定ALP及其抑制剂筛选的血糖仪方法。在优化的条件下利用该方法实现ALP的定量检测,线性范围为0.33–3.33 U/μL,检测限为0.13 U/μL,ALP在三种巴氏灭菌牛奶样品中的回收率为87.7%–116.9%。以ALP抑制剂Na2FPO3作为阳性化合物并测定其IC50值为15.4 m M。进一步利用该方法实现了十个小分子化合物和六个冬虫夏草（Cordyceps sinensis,CS）提取物的酶活性评价。结果发现腺苷-5’-单磷酸（AMP）和茶碱具有较好的酶抑制活性,而CS02和CS05提取物对ALP具有促进作用。另外,AMP和腺苷-5’-单磷酸二钠盐（AMP-2Na）上磷酸基团的存在形式（离子形式或化合物形式）可能会影响对ALP的抑制作用。最后应用分子对接技术研究单体化合物与酶的结合能以及可能的活性结合位点,并利用骨架迁越方法设计了一个新化合物。对接结果表明氢键和金属-受体相互作用是小分子配体与ALP结合过程中的重要作用力。本章研究建立了一种ALP的快速测定及其抑制剂筛选的方法,筛选结果可为ALP抑制剂的开发提供参考,同时也进一步拓展了血糖仪的应用。第八章研究中利用海藻酸钠和Ca2+之间快速的螯合作用形成水凝胶从而改变溶液黏度的原理,将葡萄糖氧化酶包埋于海藻酸钠凝胶内,随后葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和双氧水,进一步葡萄糖酸与碳酸钙反应释放Ca2+,而Ca2+又与海藻酸钠螯合形成凝胶从而改变溶液的黏度,可以利用游标卡尺测量溶液在滤膜上的扩散直径实现葡萄糖的检测。在优化的条件下利用该方法实现了葡萄糖的定量检测,线性范围为1.4–7.0 m M,定量限为1.4 m M。最后,将所建立的方法用于梨、苹果和桂圆样品中葡萄糖含量的检测,加标2.0 m M葡萄糖的水果样品中测定的回收率为91.8%–99.1%。本研究所建立的基于纸质传感检测结合视觉距离读数是一种方便、低成本且准确的方法,可为现场测定水果样品中葡萄糖的含量提供一种方法参考。第九章研究中利用壳聚糖的黏度和溶解度pH响应原理,将脲酶包埋于壳聚糖-乙酸溶胶内,随后脲酶催化尿素水解产生氨使壳聚糖-乙酸溶胶的pH值升高从而改变溶胶溶液的黏度,可以利用游标卡尺测量溶液在滤膜上的扩散直径实现尿素的检测。在优化的条件下利用该方法实现了尿素的定量检测,线性范围为3.8–15.1m M,定量限为3.8 m M。最后,将所建立的方法应用于柴油机尾气处理液中尿素含量的检测,测得回收率分别为91.4%和109.9%。本章节所建立的方法亦集成了纸基传感器和基于视觉距离的读数技术,为偏远地区尿素的POCT提供了一种简便的方法。此外,目前纳米模拟酶存在合成过程复杂和生物相容性较差,特别是重金属化合物或贵金属纳米模拟酶的一次性使用,将会造成资源浪费和环境污染等问题。因此,第十章研究中利用简便和环保的共沉淀方法制备亲水性植酸/磷酸铜（PA/Cu3（PO4）2·3H2O）,研究其类酶活性并应用于过氧化氢的检测。考察了Cu3（PO4）2·3H2O和PA/Cu3（PO4）2·3H2O的过氧化物酶样活性。然后考察了缓冲液pH、温度和孵育时间对纳米模拟酶活性的影响以及模拟酶的动力学参数Km值。PA/Cu3（PO4）2·3H2O对H2O2的Km值为4.0 m M,而对TMB的Km值为3.6 m M。在优化的条件下利用该方法实现了H2O2的定量检测,吸光度值和H2O2浓度在0.1–1.0m M和1.0–5.0 m M的两个范围内具有良好的线性关系,H2O2的检测限为79.0μM,三种牛奶样品中H2O2的检测回收率在92.4%–101.7%之间。本章所开发的方法为改善金属磷酸盐的过氧化物酶样活性提供了一种方法参考,同时还证明了用于酶固定化的无机纳米材料Cu3（PO4）2·3H2O具有类似过氧化物酶的催化活性,可为后续研究使用Cu3（PO4）2·3H2O作为酶固定载体提供参考。第十一章为结论与展望。本文围绕酶的催化作用构建了一系列活性评价和传感检测新方法。一方面,利用物理、共价以及亲和固定化酶技术分别建立了离线磁性固定化单/双酶反应器和在线毛细管电泳固定化酶微反应器,并进行了酶促动力学研究和抑制活性评价。另一方面,利用β-Glu水解底物D（-）-水杨苷产生葡萄糖以及ALP水解底物氨磷汀生成具有电化学活性的产物WR-1065的原理,分别构建了POCT方法将便携式血糖仪应用于非葡萄糖靶点的检测,实现了酶活性测定及小分子化合物或提取物的酶抑制活性评价。第三方面,分别利用GOx和脲酶催化底物产生相应的酸和碱性产物,从而改变海藻酸钠-Ca CO3和壳聚糖-乙酸溶胶溶液的黏度,可以利用游标卡尺测量溶胶溶液在滤膜上的扩散直径实现葡萄糖和尿素的快速检测。第四方面,基于PA/Cu3（PO4）2·3H2O纳米模拟酶的过氧化物酶样性质实现了H2O2的比色检测。总之,本研究采用多种固定材料和方法进行酶的固定化,建立简单、有效和高通量的筛选方法可为从天然产物中发掘有效的酶抑制活性成分提供方法参考。其次,构建基于便携式血糖仪和肉眼可读的纸基定量检测方法对于在偏远地区和紧急公共卫生事件发生后对目标分析物的快速有效的识别和测定具有重要应用价值,同时也拓展了血糖仪的应用。此外,提出了一种通用、简单、绿色和快捷的增强纳米模拟酶类过氧化物酶样活性的方法,丰富了纳米模拟酶研究。最后,在现有的工作基础上,对未来的研究工作进行了展望。