萝卜CMS分子标记与小孢子发生细胞学和差异表达研究

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萝卜(Raphanus sativus L.)是一种非常重要的蔬菜作物,其具有明显的杂种优势,以细胞质雄性不育系为母本,实行三系配套的制种方式是萝卜杂种优势利用的重要途径。本研究利用多个雄性不育系与保持系配制的子代群体,筛选恢复基因,将其与不育系进行杂交,对杂种和不育系母本进行差异显示;建立适用于萝卜的RAMP体系,并应用于萝卜的可育与不育品种;综合利用光镜、电镜和差异显示技术对中国萝卜的CMS性状进行研究。 提取萝卜嫩叶总DNA,利用针对orfl38基因区域设计的两套引物对供试品种进行检测,得到长度约为780bp和280bp的扩增产物,这两种产物的扩增结果在材料中表现一致。将保持系B1与不育系A1,A5中的780bp扩增产物进行回收、纯化和测序,发现分别与报道的orfl38基因序列同源性为100%,且不同材料中的orfl38基因差异不大,同源性为97.75%。同时利用针对恢复基因的连锁STS标记设计的引物,在供试材料中对恢复基因进行筛选,结果发现只有“东方黑大根”具有恢复基因。雄性不育受环境的影响,不育系中会出现可育植株,而保持系中也会出现不育植株,将育性变异的植株进行orfl38基因和恢复基因的筛选,结果与育性正常的植株一致,可能是只与花粉有关的一些因素发生了变化。将“东方黑大根”与不育系进行杂交形成杂交种,对杂交种和母本不育系进行差异显示比较,结果发现差异条带多为不育系具有,经过比较分析,差异条带多植物中的核糖体RNA同源性较高。 建立适合于萝卜的分子标记RAMP体系。对RAMP分析体系中的Mg2+、dNTPs和引物浓度进行优化,分别设计3个浓度梯度:mg2+为0.75,1.5,3.0mmol·L-1;dNTPs为0.05,0.15,0.3mmol·L-1;引物为0.065,0.2,0.4μmol·L-1,并对合适的复性温度进行研究。筛选出的RAMP优化体系为(20μl):dNTPs 0.15mmol·L-1,Mg2+1.5mmol·L-1,引物0.2~0.4μmol·L-1,DNA 10ng,Taq E 0.8U;PCR扩增程序为94℃3min,94℃ 1min,45℃ 1min,72℃ 1.5min,42个循环,72℃ 8min。运用此体系,进行引物组合筛选,并对7个萝卜品种的遗传多样性与品种鉴定进行RAMP标记分析。将建立的RAMP体系应用于萝卜的雄性不育,发现不育系与保持系之间没有明显的差异,而具有恢复基因的“东方黑大根”与其余没有恢复基因的品种之间有明显的差异,说明RAMP标记可以应用于萝卜恢复基因的确定。
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