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为抵御病原菌的侵染植物进化出 PTI(PAMPs-triggered immunity)和 ETI(effector-triggered immunity)两种免疫系统。WRKY转录因子作为正调控因子或负调控因子参与植物的抗病过程。本文主要研究水稻WRKY Ⅱa亚组的两个成员OsWRKY76和OsWRKY62的协同抗病功能。OsWRKY76.1和OsWRKY62.1的氨基端和羧基端都含有coiled-coil结构域,推测两者可能发生互作。我们通过酵母双杂交、pulldown、BiFC实验证实了两者可以形成同源或异源二聚体。几丁质,鞭毛蛋白flg22,MeJA和伤处理都能诱导OsWRKY76和OsWRKY62的表达,且两者诱导表达趋势基本一致。为了进一步明确Os WRKY76.1和Os WRKY62.1的生物学功能,我们获得了两者的超表达株系、干涉株系以及敲除株系。Os WRKY76.1、OsWRKY62.1超表达植株降低了对稻瘟菌(Magnaporthe oryzae SZ)和白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv oryzae J18,(Yoo))的抗性,然而 OsWRKY76、OsWRKY62干涉植株及敲除植株增强了对两种病原菌的抗性。烟草瞬时表达分析发现OsWRKY76.1和OsWRKY62.1都具有转录抑制活性。因此OsWRKY76.1、OsWRKY62.1作为转录抑制因子调控水稻的抗病性。通过RNAi技术,我们获得了 11个同时干扰Os WRKY76和OsWRKY62表达的双干涉株系。与单干涉植株相比,双干涉植株显著增强了对M oryzae SZ和Xoo J18的抗性,并且提高了防卫相关基因的表达和植保素积累。上述结果表明Os WRKY76.1和OsWRKY62.1可能协同调控水稻的抗病性。采用基因编码区3’端的引物进行real time PCR分析,发现OsWRKY76、OsWRKY62的表达量在OsWRKY76干涉植株及双干涉植株中均升高,且两者在双干涉植株中表达量更高。使用能扩增基因整个编码区的引物进行RT-PCR分析,发现Os WRKY76和Os WRKY62都存在选择性剪切,剪切转录本分别命名为Os WRKY76.2和OsWRKY62.2;且Os WRKY62.2受MeJA和稻瘟菌诱导。正常转录本与剪切转录本的比例(OsWRKY76.1/76.2、OsWRKY62.1/62.2)在双干涉植株以及稻瘟菌侵染过程发生较大变化。OsWRKY76和OsWRKY62不同转录本编码的蛋白之间可以互作,且OsWRKY76.2或OsWRKY62.2可干扰OsWRKY76.1和OsWRKY62.1之间的互作。烟草瞬时表达分析发现OsWRKY62.2丧失了转录抑制活性,并能干扰OsWRKY76.1和OsWRKY62.1的转录抑制活性。通过对OsWRKY62.1氨基端的39个氨基酸进行依次缺失及突变,发现了 PTDDSAAAG和EDLEEK两个转录抑制域。EMSA实验表明OsWRKY76.2、OsWRKY62.2降低了对W-box的结合能力。以上结果表明Os WRKY76和Os WRKY62不同转录本的生物学功能各有差异,它们可能在水稻抗病过程中形成了一个复杂的调控网络。RT-PCR分析发现Os WRKY76和OsWRKY62的表达量在OsWRKY76和Os WRKY62敲除植株中均升高,ChIP-PCR结果表明OsWRKY62.1可以结合自身启动子以及Os WRKY76启动子中的W-box簇,这些结果表明Os WRKY76和Os WRKY62存在相互调控机制。从Os WRKY62.1超表达植株中免疫纯化OsWRKY62.1蛋白并进行质谱分析,发现OsWRKY62.1存在多种翻译后修饰形式,如磷酸化、泛素化等,这可能与它的生物学功能密切相关。