论文部分内容阅读
目的利用基因工程技术制备来源于病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N末端的GST融合蛋白，并通过体外乳腺癌细胞增殖、克隆形成、粘附以及趋化抑制实验检测其抗乳腺癌生物学活性。方法根据vMIP-Ⅱ的氨基酸序列(GenBank: AAB62642)以及编码vMIP-Ⅱ的ORF K4基因(GenBank：U93872.2:21495..21779)的核苷酸的序列确定编码vMIP-ⅡN末端21个氨基酸肽的核苷酸序列作为目的基因；将设计好序列的两条互补核苷酸链由上海生工生物工程有限公司合成；两条人工合成的核苷酸链经退火形成双链DNA；利用T4DNA连接酶将人工合成的目的基因与经过酶切、纯化的高效原核表达载体pGEX-KG进行连接；连接后的重组质粒pGEX-KG-NT21MP转化至E.coli BL21(DE3)；挑取阳性克隆摇菌，送上海生工生物工程有限公司进行基因测序；利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)对重组菌进行诱导表达；经亲和层析、超滤、快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)纯化重组融合蛋白GST-NT21MP；通过Western Blot对GST-21MP进行免疫学鉴定；采用MTT法，检测GST-NT21MP对SDF-1α诱导的乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞增殖的抑制作用；软琼脂集落形成实验评价GST-NT21MP对SK-BR-3乳腺癌细胞克隆形成率的影响；粘附实验检测不同浓度的GST-NT21MP作用下SK-BR-3细胞对纤维连接素(fibronectin,FN)粘附能力的变化；利用Transwell检测GST-NT21MP对SDF-1α诱导SK-BR-3细胞趋化的抑制实验。结果重组质粒pGEX-KG-NT21MP经测序鉴定构建成功；重组蛋白最佳诱导表达条件是0.8mmol/L IPTG，37℃诱导表达5小时；诱导表达的GST-NT21MP在胞质内主要以可溶性的形式存在；经过纯化获得纯度大于99%的GST-NT21MP；GST-NT21MP可以浓度依赖的方式抑制SK-BR-3细胞的增殖(P <0.05)、软琼脂集落的形成(P <0.05)、及对FN的粘附(P<0.05)；在趋化抑制实验中，GST-NT21MP可抑制SDF-1α诱导的SK-BR-3细胞趋化作用（P <0.05）。结论成功在大肠杆菌中诱导表达了vMIP-ⅡN末端的GST融合蛋白GST-NT21MP；经过纯化获得了高纯度的GST-NT21MP；GST-NT21MP能够抑制由SDF-1α诱导SK-BR-3乳腺癌细胞的增殖、克隆形成、粘附和趋化活性，可作为治疗乳腺癌的靶向药物。