趋磁细菌研究方法及模式菌AMB-1生理特性研究

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趋磁细菌是一类能在细胞内积累生物膜包被的,纳米尺寸、单磁畴级别晶体颗粒(磁小体)的细菌。磁小体在细胞内呈链状或丛状排列,作为细菌的“生物磁针(biocompass)”,感受地球磁场或外加磁场,使菌体沿磁场方向定向游弋或排列,这种特性也叫“趋磁性”。由于趋磁细菌独特的磁场运动特性、牛物学特性以及磁小体作为生物活性物质的固定载体、磁记忆材料等方面广阔的应用前景,趋磁细菌和磁小体的研究引起了微生物学、生物磁学、地质学和材料学领域学者的兴趣。30年来,研究者在诸如趋磁细菌的生态分布、菌种分离筛选、系统进化和分类以及菌体生理生化特征,磁小体的物化特性、合成机制和牛物矿化过程等方面,对趋磁细菌展开了深入系统的研究,同时,磁小体在磁性纳米材料、牛物医药工程等领域的应用也得到了广泛的研究。 磁螺菌AMB-1(Magnetospirillum sp.AMB-l)是Mataunaga等从日本东京一天然淡水泉沉积物(pH6.5-7.0)中分离得到的一株螺旋形趋磁细菌。与其它纯培养的趋磁细菌相比,AMB-1氧耐受度高,微好氧和厌氧条件下合成Fe<,3>O<,4>型磁小体,该菌可以在琼脂固体平板上生长,形成不含磁小体的白色菌落或含磁小体的棕黑色菌落。因此,AMB-1是研究趋磁细菌非常合适的模式菌株,该菌的全基因组测序也完成。但目前人们对磁小体生物矿化的精细过程仍不清楚,磁小体发酵生产的产量仍然很低,制约了磁小体的研究应用。 由于缺乏必要的趋磁细菌测量系统和趋磁细菌的研究方法,以及菌株分离培养难度极大,国内的趋磁细菌研究进展比较缓慢。本论文以磁螺菌AMB-1(Magnetospirillum sp.strain AMB-1,ATCC 700264)为模式菌株,对趋磁细菌的物理表征及其生理特征等方面开展了细致的研究,有许多新发现,对趋磁细菌的物理与生理特征有了新的认识。本项研究取得如下研究结果: ①建立了趋磁细菌的磁场运动性观察和趋磁细菌磁分离方法 利用条形磁铁形成的简单磁场,建立了利用标准液滴法进行趋磁细菌磁场方向定向运动性观测方法,发现含有磁小体的AMB-1细胞沿磁场方向分层相向快速运动。简化了AMB-l双吸收法测定细胞磁敏性系数(Cmag的方法,确定了细胞平均磁小体数量和Cmag具有一定的相关性。根据磁场T作距离,改进和设计了毛细管磁分离器、水平式磁分离器和倒置式磁分离器,使川条形磁铁形成的梯度磁场(磁分离时问:15-20min)或者使用Helmholtz电磁线圈形成的均匀磁场(磁感应强度:2-20Gs,磁分离时问:10-15min)成功实现了混合菌悬液中含磁小体AMB-1菌株的分离纯化。利用建立的趋磁细菌磁分离方法,对取自山东省境内的部分样品进行了分离筛选,得到了几株含电子致密颗粒的细菌。 ②建立了产磁能力强AMB-l菌株的快速筛选方法 AMB-l连续培养过程中,易发生磁小体合成能力减弱或丧失的突变。通过试验,改进了毛细管磁分离器,利用该分离器将液体深层培养中产磁能力强,运动性好的AMB-l菌株快速分离筛选出来。 ③研究了AMB-l液体培养特性和磁小体合成进程 研究结果了不同的培养基体系对菌体的生长和磁小体合成影响,确定了适合AMB-l菌体生长和磁小体合成的培养基成分,添加琥珀酸和硝酸钠以及多肽、巯基乙醇酸钠等少量有机物,有利于AMB-l菌体生长和磁小体合成。研究发现:某一浓度的氧气能促进AMB-1生长,但抑制细胞的运动性和磁小体合成能力;采用前期振荡培养获得菌体最大生长量,后期静止培养生产磁小体的两步发酵法,并不适用于发酵AMB-1生产磁小体;初始菌种(培养到指数生长期前期)是否含磁小体对菌体的生长进程影响不大,但对磁小体合成略有影响,缺铁静止培养所得的菌种进行静止含铁培养时,细胞具有更强的磁敏性;加大接种量不能改变菌体的最大生长量,但能缩短延迟期;铁是合成磁小体的必需元素,在一定浓度范围内,铁能制约细胞合成磁小体的总量,但加大初始奎尼酸铁的浓度,并不能增加磁小体的合成。研究发现,磁小体的合成发生在菌体的指数牛长期和稳定期,从头合成磁小体的细胞能同时合成多个磁小体雏形,磁小体的合成过程表现为磁小体数目的增加和颗粒的成熟。
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