背景:心血管疾病目前仍然是引起全世界范围内死亡率较高的疾病之一。大多数心脏疾病的病理生理过程都与氧化应激损伤有关。高血压、心肌梗死、动脉粥样硬化等常见的心血管疾病的病理生理过程都包含了心肌细胞和血管内皮细胞等的氧化应激损伤。氧化应激损伤被认为是造成血管内皮功能紊乱的主要原因,是一种由于活性氧（ROS）产生增加和自身抗氧化防御系统功能降低引起的失衡。ROS的升高会引起血管内皮细胞发生炎性反应、凋亡、细胞增殖、迁移等,继而影响血管的弹性功能和结构,在心血管疾病的形成中发挥了重要作用。近年来,越来越多的研究表明血管内皮损伤是大多数心血管疾病过程的重要阶段。在疾病状态下,血管内皮接受到生物化学和血流动力信号改变做出应答,包括重新编辑表达基因、细胞增殖和迁移、细胞衰老、细胞自噬和凋亡等,从而引起血管及周围组织损伤。因此,减少血管内皮的氧化应激损伤有助于为心脑血管的疾病提供新的治疗方案。Pax9是一个转录因子,是Pax家族中的一员,这个家族的蛋白具有含特定的DNA结合位点的共同特点。之前的大多数研究都表明Pax9在胚胎发育和肿瘤发生及颌面发育中起到重要作用。直至最近两年,才有两项研究报道Pax9参与了心血管的发育过程。此外,Pax9与很多信号通路中的分子存在相互作用并且起到重要的中间分子作用。我们团队之前的研究发现,Pax9可以提升平滑肌细胞的增殖迁移水平。综上所述,我们猜测Pax9很可能参与了心血管疾病的病理生理过程。然而,目前还没有研究报道Pax9是否参与心血管疾病中的内皮损伤过程。细胞的死亡是一个复杂且精密控制的过程。凋亡是一种程序性细胞死亡过程,通常由特定的基因编辑。在过去的几十年中,凋亡被认为在细胞死亡中占据了重要的地位。关于凋亡的研究不断深化,近些年的研究发现,细胞的命运不仅仅是由细胞凋亡单独决定,细胞的死亡过程可以大致分为三种形式:凋亡、自噬和坏死。自噬与凋亡之间存在复杂的相互调控。凋亡的起始可能是由于自噬,但终末阶段又会在凋亡汇合。自噬通常在各种压力条件下被诱导,例如细胞器功能失调、萎缩、化学疗法干预、饥饿等。如果压力被控制,细胞可通过自噬保持稳态并回到起始状态。然而,如果压力持续存在,自噬无法支持细胞继续生存,则会激活凋亡以减少周围细胞及组织受损。凋亡与自噬的蛋白网络有交叉的部分,因此二者之间存在很多直接或间接的相互作用。他们之间的相互作用在细胞的生存与死亡之间构成平衡。本研究将探究Pax9在血管内皮氧化应激损伤中的表达,Pax9是否可以通过对自噬和凋亡的调控参与血管内皮氧化应激损伤的疾病过程,以及Pax9减轻或加重血管内皮氧化应激损伤的具体机制。目的:明确Pax9在血管内皮氧化应激损伤中的表达及探究Pax9在血管内皮氧化应激损伤中的作用及具体机制材料与方法:第一部分:在大鼠血管组织水平观察氧化应激损伤对Pax9表达的影响。实验对象为4-6周的雄性SD大鼠,在室温以普通鼠粮养殖3天后,待大鼠适应环境情况稳定,对其进行手术。同一只大鼠的左颈总动脉为氧化应激损伤手术组,右颈总动脉为对照组。对大鼠进行麻醉,对左颈总动脉实施氧化应激损伤刺激,刺激后将大鼠的皮肤缝合,继续以普通鼠粮在室温环境中饲养。48小时后取双侧颈总动脉组织。对得到的组织进行western blot及免疫组化检测,观察Pax9表达的变化。第二部分:在人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）中探究氧化应激损伤对Pax9的影响以及Pax9对血管内皮细胞凋亡的影响。首先,给予浓度梯度递增（0,100,200,400umol/L）的过氧化氢（H2O2）刺激12小时,通过western blot观察H2O2对Pax9表达水平和凋亡相关蛋白的影响,通过ROS荧光实验观察ROS累积水平,通过CCK-8实验观察HUVEC的细胞活力,通过流式细胞术测量HUVEC细胞的凋亡率。接下来,分别在过表达和敲减Pax9的情况下给予H2O2刺激,通过western blot检测Pax9对凋亡水平的影响,通过ROS荧光实验观察过表达或敲减Pax9对ROS累积水平的影响,通过CCK-8实验检测过表达或敲减Pax9对HUVEC细胞活力的影响,通过流式细胞术测量过表达或敲减Pax9对HUVEC凋亡率的影响。第三部分:在人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）中,探究在氧化应激损伤中Pax9对自噬的影响及具体机制并探究在氧化应激损伤的情况下内皮细胞中凋亡和自噬的调控关系。首先,分别在过表达和敲减Pax9的情况下给予H2O2刺激,通过western blot检测自噬相关蛋白,确定Pax9对自噬水平的影响。接下来,用免疫共沉淀实验（Co IP）观察Pax9是否与P62结合。给予H2O2刺激,观察Pax9与P6的结合程度是否发生改变。最后,由于实验发现敲减Pax9会促进自噬,因此用3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬观察凋亡水平的变化,探究在血管氧化应激损伤中凋亡与自噬的调控。Western blot条带的灰度值均由image J（Ver 1.8.0）软件测量。ROS及免疫组化细胞面积由image J软件测量。细胞活力检测试验（CCK-8）中细胞的吸光光度值由酶标仪测量。Western blot、ROS荧光、免疫组化、流式细胞术图片均由Photoshop2019处理。所有的条形统计图由Graphpad Prism（Ver 7.0.4）软件制作。所有实验结果的统计学分析由SPSS（IBM）软件完成,结果显示为平均值±标准误。统计学方法为独立样本T检验分析和单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05为数据间的差异具有统计学意义。结果:1、第一部分:与大鼠右颈总动脉组织假手术组相比,在经过H2O2刺激的大鼠左主动脉组织手术组中Pax9的表达降低。与此同时,我们发现自噬相关蛋白LC3II的表达也降低。说明血管内皮的氧化应激损伤引起了自噬反应的升高。2、第二部分:（1）随着H2O2浓度升高,Pax9表达逐渐降低,凋亡相关蛋白caspase3、Bax/BCL2逐渐升高。ROS累积水平随着H2O2浓度升高逐渐升高,HUVEC的细胞活力随着H2O2浓度升高逐渐降低。流式细胞术的结果与western blot结果相一致,随着H2O2浓度升高HUVEC的凋亡率逐渐升高。（2）将细胞分为四组:con组,con+H2O2组,过表达Pax9组,过表达Pax9+H2O2组。与con+H2O2组相比,过表达Pax9+H2O2组表现出凋亡相关蛋白caspase3、Bax/BCL2表达降低。这说明过表达Pax9可以抑制血管内皮氧化应激损伤引起的HUVEC凋亡。此外,与con+H2O2组相比,过表达Pax9+H2O2组表现出ROS累积水平降低,细胞活力升高,HUVEC凋亡率降低。（3）将细胞分为四组:con组,con+H2O2组,敲减Pax9组,敲减Pax9+H2O2组。与con+H2O2组相比,敲减Pax9+H2O2组表现出凋亡相关蛋白caspase3、Bax/BCL2表达升高。这表明敲减Pax9会促进血管内皮氧化应激损伤引起的HUVEC凋亡。3、第三部分:（1）在H2O2诱导的血管内皮氧化应激损伤中,随着H2O2浓度升高,自噬相关蛋白LC3II/LC3I逐渐升高,P62逐渐降低。（2）依然将细胞分为四组:con组,con+H2O2组,过表达Pax9组,过表达Pax9+H2O2组。与con+H2O2组相比,过表达Pax9+H2O2组表现出自噬相关蛋白LC3II/LC3I表达降低,P62表达升高。这表明过表达Pax9可以抑制血管内皮氧化应激损伤中引起的HUVEC自噬。（3）将细胞分为四组:con组,con+H2O2组,敲减Pax9组,敲减Pax9+H2O2组。与con+H2O2组相比,敲减Pax9+H2O2组表现出自噬相关蛋白LC3II/LC3I表达升高,P62表达降低。（4）由于前面的实验已确认敲减Pax9会同时引起HUVEC的自噬和凋亡,因此我们探究血管内皮氧化应激损伤中自噬和凋亡的互相调控。当在敲减Pax9的情况下加入自噬抑制剂3-MA时,原本由于敲减Pax9引起的凋亡升高发生了降低。这表明敲减Pax9引起的自噬参与了血管内皮氧化应激损伤引起的细胞凋亡。（5）免疫共沉淀实验表明,Pax9可以与自噬底物P62发生结合,并且两者的结合随着H2O2的刺激减轻。该结果与前面实验得到的结果相一致。说明H2O2刺激后,由于结合减轻,Pax9对自噬的抑制作用减轻,从而造成氧化应激损伤下的凋亡升高。结论:（1）在血管内皮氧化应激损伤中Pax9在的表达水平降低。（2）Pax9可以抑制血管内皮氧化应激损伤中的HUVEC凋亡。（3）Pax9可以通过与自噬底物P62结合从而抑制血管内皮氧化应激损伤中的HUVEC自噬。（4）在血管内皮氧化应激损伤中,敲减Pax9引起的自噬参与了HUVEC的凋亡。