论文部分内容阅读
目的:掌握CMVECs原代培养技术,制备多组大鼠心脏微血管内皮细胞脂多糖损伤模型,通过显微镜对细胞形态进行观察,为后续实验提供形态学依据。探讨乌司他丁(UTI,Ulinastatin)预处理对LPS诱导损伤心肌微血管内皮细胞相关炎性反应的影响。探究乌司他丁对LPS诱导损伤的CMVECs凋亡及相关机制的研究。探讨乌司他丁对脓毒症大鼠心脏损伤的保护作用机制,为后期临床早期用乌司他丁治疗机体脓毒症心肌损伤提供理论依据。方法:选取大鼠心肌组织,用PBS液洗除血液,同时对大鼠心脏细胞进行培养,直至长成细胞单层,选第3代内皮细胞,0.25%胰蛋白酶消化后将上述细胞分成6组:(1)空白对照组:加入无血清培养基;(2)模型组1:加入含0.01μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(3)模型组2:加入含0.1μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(4)模型组3:加入含1μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(5)模型组4:加入含10μg/ml LPS的无血清培养基作用24h;(6)模型组5:加入含100μg/mlLPS的无血清培养基作用24h。在倒置显微镜下、扫描显微镜及透射显微镜下观察孵育前和孵育24h后内皮细胞形态学改变情况。对于大鼠心脏微血管内皮细胞脂多糖损伤模型进行继续培养干预:1)对照组不做任何处理;2)阿托法他汀(10000u/ml)预处理组;3)低浓度(5000u/ml)乌司他丁预处理组;4)中浓度(10000u/ml)乌司他丁预处理组;5)高浓度(20000u/ml)乌司他丁预处理组;通过免疫组化以及Western blot等检测方法对处理前后各组细胞进行炎性因子检测,具体指标包括白细胞介素(IL-1)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞自噬相关蛋白Atg5,Beclinl和LC等在细胞内的表达情况;后期进行数据总结和分析;通过Western blot法检测各组内皮细胞中Bcl-2、bax蛋白表达水平的变化;MTT法检测各组细胞活力;流式技术检测各组细胞凋亡率。健康清洁级雄性Wistar大鼠60只,随机分成6组,每组大鼠10只;术前禁食12小时,建立脓毒症大鼠模型,具体实验分组如下:对照组,大鼠不做任何处理;假手术组:术后给予等容量的0.9%生理盐水;阿托法他汀组(50000U/kg);乌司他丁低浓度组(20000U/kg),乌司他丁中浓度组(50000U/kg),乌司他丁高浓度组:术后24小时采取大鼠动脉血及分离左心室心肌细胞,观察细胞的具体变化,同时采用取尾静脉血用美联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清心肌钙蛋白I及肿瘤坏死因子TNF-α,放射免疫治疗检测大鼠心肌内皮素-1及相关心肌丝裂原活化蛋白激酶的表达水平,后期分析实验数据。结果:与正常对照组相比,随着LPS浓度的增加,大鼠心脏微血管细胞内皮损伤程度逐步严重;光镜结果显示随着LPS浓度的增加,内皮细胞由立方形逐渐变成多边型甚至是扁平型;同时观察到小血管周围间隙明显增宽,细胞数量减少,排列紊乱;扫描电镜结果显示内皮细胞凹陷,绒毛萎缩、扭曲;透射电镜显示随着LPS浓度的增加,细胞核逐渐固缩,高尔基体复合高度扩张,线粒体病变出现空泡性,同时细胞出现纤维状脂蛋白沉淀现象;上述现象,随着LPS浓度增加,现象逐渐严重。IL-1、IL-6、IL-8水平比较:在高UTI组、中UTI组、低UTI组、阿托法他汀组、对照组中,三种细胞因子含量不断上升,各组之间P值均小于0.05,差异具有统计学意义;TNF-α水平比较:在高UTI组(300.87±12.89ng/ml)、中UTI组(388.30±12.80ng/ml)、低UTI组(430.26±12.11ng/ml)、阿托法他汀组(500.99±14.33ng/ml)、对照组(658.88±15.37ng/ml)中,TNF-α含量不断上升,P值分别为0.000,0.001,0.029,0.036与0.049,差异具有统计学意义;自噬相关蛋白IL-1β及LC3-1表达情况:在高UTI组、中UTI组、低UTI组、阿托法他汀组、对照组中,自噬相关蛋白IL-1β及LC3-1含量不断上升,各组间P值均<0.05,差异具有统计学意义。细胞凋亡率指数及凋亡率比较:在高UTI组(0.18±0.08,0.23%)、中UTI组(0.35±0.13,0.59%)、低UTI组(0.45±0.13,0.72%)、阿托法他汀组(0.78±0.19,1.13%)、对照组(2.23±0.23,4.56%)中,细胞凋亡率以及凋亡指数不断升高,各组间P值分别为0.003,0.048,0.030,0.039,0.000,差异具有统计学意义;内皮细胞Bcl-2蛋白含量比较:在对照组、阿托法他汀预处理组、低UTI组、中UTI组、高UTI组中,Bcl-2蛋白表达不断上升,各组间P值均小于0.05,差异具有统计学意义;Bax蛋白含量比较:在高UTI组、中UTI组、低UTI组、阿托法他汀组、对照组,Bax蛋白表达水平不断上升,各组间P值均小于0.05,差异具有统计学意义。心肌蛋白cTnl表达水平分析:在假手术组(1.00±0.56ng/ml)、高UTI组(1.23±0.23ng/ml)、中UTI组(2.56±0.38ng/ml)、低UTI组(3.03±0.58ng/ml)、阿托法他汀组(4.33±0.46ng/ml)、对照组(6.98±0.39ng/ml)中,心肌蛋白cTnl含量不断上升,各组间P值均小于0.05,差异具有统计学意义;血清TNF-α浓度水平比较:在假手术组(211.87±35.48pg/g)、高UTI组(238.23±30.23pg/g)、中UTI组(273.55±51.04pg/g)、低UTI组(345.88±30.88ng/ml)、阿托法他汀组(457.34±45.27ng/ml)、对照组(766.78±43.89ng/ml)中,血清TNF-α浓度含量不断上升,各组间P值均小于0.05,差异具有统计学意义;内皮素ET-1表达水平分析:在假手术组(168.34±27.71pg/g)、高UTI组(170.44±28.79pg/g)、中UTI组(234.34±29.33pg/g)、低UTI组(278.99±28.34ng/ml)、阿托法他汀组(344.62±27.85ng/ml)、对照组(677.32±38.74ng/ml)中,含量不断上升,P值均小于0.05,P值分别为<0.01,<0.01,0.003,0.001,0.025与0.003,差异具有统计学意义。结论:脂多糖可以对大鼠心脏细胞产生内部损伤行为,且其损伤程度与LPS浓度的变化呈现正相关性。乌司他丁对减缓和抑制LPS诱导损伤的心肌微血管内皮细胞炎性反应具有实质性效果;乌司他丁可以有效抑制LPS诱导损伤的心肌微血管内皮炎性细胞的凋亡过程;乌司他丁可以有效的降低脓毒血症大鼠心肌蛋白质水平含量,减少炎症反应的发生,降低大鼠的死亡率,可以考虑在临床上开展相关临床药物实验。