论文部分内容阅读
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma NPC)是耳鼻咽喉科最常见的肿瘤，发病率在头颈部恶性肿瘤中居于首位，我国南方地区发病率极高，严重威胁着人民的健康和生命。咽隐窝为NPC的好发部位，其位置较深，周围比邻重要的组织和神经，与多条淋巴管想通，所以发病初期极易发生临近部位的侵袭和淋巴结的转移，临床症状不典型而容易被误诊和漏诊。由于鼻咽癌细胞生长极为快速，常呈浸润性生长，解剖部位不宜暴露，很难对病灶直接手术切除。虽然鼻咽癌对放疗或者化疗较为敏感，但是到目前为止，放疗、化疗或者放化疗联合的治疗效果并不理想。随着分子生物学和免疫学技术的发展，鼻咽癌的分子靶向治疗成为该研究领域的热点。 分子靶向治疗是新兴的一种肿瘤生物治疗模式，与传统的治疗方法相比已经凸显出较好的治疗效果和较低的毒副作用，分子靶向治疗的首要条件是寻找与肿瘤发生发展的重要靶点。c-Met是原癌基因met的编码产物，它属于生长因子受体家族成员，具有酪氨酸激酶活性，在正常组织中低表达或者不表达，但在多种肿瘤组织中异常高表达。c-Met是肝细胞生长因子(hepatocyte growthfactor，HGF)在体内的唯一受体，又称为肝细胞因子受体，二者持续性结合使癌细胞具有侵袭和易于转移的特点，因此HGF或者c-Met成为肿瘤分子靶向治疗的关键靶点。目前单克隆抗体靶向治疗在分子靶向治疗中显示出良好的抗癌效果，但是如鼠源性单克隆杭体引起的人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibodyHAMA)限制了鼠源单抗在临床中的应用，这使得人源单克隆抗体应运而生。比如人源全分子单抗不仅可以识别肿瘤细胞的表面抗原，并与之特异性结合而阻止其与体内的配体结合，而且全分子中的Fc段可以诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，诱导细胞凋亡。 本课题组前期构建了全人源Fab抗体库，此次实验通过基因工程技术和抗体工程技术，制备和表达具有中和活性的人源全分子抗c-Met抗体，对该抗体进行免疫学活性鉴定，并观察其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响，为探索c-Met作为靶点进行鼻咽癌的分子靶向治疗奠定基础。 目的: 1.表达并纯化人源全分子抗c-Met抗体，分析鉴定其免疫学活性，并检测抗体亲和力; 2.在细胞水平上观察人源全分子抗c-Met抗体对鼻咽癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。 方法: 1.构建重组人源全分子抗c-Met抗体的真核表达载体:扩增人源抗c-Met Fab抗体重轻链可变区，将其扩增的产物分别克隆到酶切的真核表达载体（含人源重轻链恒定区）中，转化大肠杆菌DH5α后，挑选阳性克隆送检测序，分析序列并确认正确。 2.获得人源全分子抗c-Met抗体:将测序正确的真核重组载体转染到293Freestyle(293F)细胞中，6天后收集细胞培养上清。通过Protein A亲和层析柱和AKTA蛋白纯化系统纯化抗体。 3.鉴定人源全分子抗c-Met抗体的免疫学特性:通过ELISA、Westernblot和免疫荧光分析人源全分子抗c-Met抗体的免疫学特性。 4.根据BLItz分子间相互作用系统原理，用BLItzPro1.0软件分析亲和力结果。 5.用CCK-8法分析人源全分子抗c-Met抗体对鼻咽癌细胞的生长增殖的影响; 6.用细胞划痕、Transwell侵袭实验检测人源全分子抗c-Met抗体对鼻咽癌细胞的迁移和侵袭的影响。 结果: 1.采用PCR分别扩增出长度348bp的VH基因和324bp的VL基因，通过序列比对、设计引物及酶切载体，经Infusion PCR获得c-Met重轻链重组载体，转化大肠杆菌DH5α后测序正确。 2.使用293Free style Expression System真核表达系统获人源全分子抗c-Met抗体，产率约2mg/100ml，SDS-PAGE结果显示，抗体纯度较好。重链和轻链分别为55kD和25kD左右。 3.ELISA显示人源全分子抗c-Met抗体与重组c-Met蛋白可特异性结合，并具有较好的量效关系;Western blot结果显示，人源全分子抗c-Met抗体能够与鼻咽癌阳性细胞结合，免疫荧光检测显示人源全分子抗c-Met抗体可以识别鼻咽癌细胞表面的c-Met蛋白。 4.CCK-8法检测结果表明，与阴性细胞相比高，该抗体对高表达c-Met蛋白的鼻咽癌细胞增殖的抑制率明显高于阴性细胞的抑制率，差异有统计学意义(P＜0.05)。 5.BLItzPro1.0软件分析:亲和力KD为5.56×10-10M。 6.细胞划痕结果显示:该抗体对鼻咽癌阳性细胞的划痕愈合率明显低于阴性细胞，差异具有统计学意义(P＜0.05);迁移和侵袭实验结果表明:鼻咽癌阳性细胞对照组平均穿膜细胞数明显多于实验组，差异有统计学意义(P＜0.05)，阴性细胞在迁移实验和侵袭实验中差异没有统计学意义(P＞0.05)。 结论: 1.本研究成功构建了人源全分子抗c-Met抗体的重组表达载体，成功获得纯化后的人源全分子抗c-Met抗体，该抗体可特异性识别鼻咽癌细胞表面的c-Met蛋白，经检测，该抗体具有较高的亲和力。 2.人源全分子抗c-Met抗体对鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭有抑制作用。