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Rs1046AB是派生于宜3A的细胞核雄性不育系,遗传分析表明Rs1046AB的育性受一个复等位基因位点控制,它们的显隐性关系为恢复基因型(BnMs5a)>不育基因型(BnMs5b)>保持基因型(BnMs5c)(洪登峰,2006)。利用Rs1046AB中的不育株Rs1046A与其恢复系19514A杂交构建的一个F2作图群体,本课题组已将BnMs5位点定位于标记SCD8和SC6之间1.1cM的遗传区间内。并以BnMs5两侧最近标记SCD8和SC6为探针筛选了甘蓝型油菜Tapidor(在BnMs5位点基因型为BnMs5c) BAC文库,获得了可能覆盖目标基因区段的29个阳性克隆。为了克隆该不育基因位点并解析其育性遗传的分子机理,本研究对上述阳性克隆分组和测序,开发出一个与BnMs5紧密连锁的标记,从而将BnMs5定位在一个BAC克隆上约21-kb的物理区段内,并最终通过遗传互补实验证实其中一个候选基因即为BnMs5位点的目标基因。其主要结果如下：1. BnMs5位点起源。利用12个与BnMs5连锁标记的序列比对白菜和甘蓝全基因组序列,发现绝大多数标记能够在白菜MF2亚基因组及甘蓝subgenome Ⅱ亚基因组的鉴定出高度同源区,且这些同源区在白菜或甘蓝基因组上的排列顺序与上述标记在BnMs5附近的排列顺序基本一致。与BnMs5连锁的标记SCD2亦可定位在甘蓝型油菜TNDH群体(Long et al,2007)的A8染色体上。因此,推测BnMs5位点起源于白菜MF2亚基因组。2.目标BAC克隆鉴定。利用7组位于候选基因区段的亚基因组特异或保守的PCR引物将可能包含BnMs5位点的29个阳性克隆分为6组。在获得第1组中编号为JBnB007P02的BAC克隆的插入片段序列后,开发出BnMs5一侧最近且在F2群体中呈共显性遗传的标记BE10。利用BE10重新分析上述6组BAC克隆后确认目标BAC克隆位于第1II组中,而第1组克隆中的JBnB007P02则是和目标区段高度同源的拷贝。3.候选基因预测。以白菜已测序BAC克隆KBrB111O21的序列为参考,从第1II组编号为JBnB034L06的BAC克隆中分离了两侧最近标记SCD8-2和BE10之间的完整序列。基因预测显示该21-kb的候选基因区段包含8个潜在的开放读码框。除ORF2和ORF3为反转录转座子相关基因外,其余6个开放读码框都可能为BnMs5的候选基因。4.亲本中候选基因序列分离。参考JBnB034L06的可利用信息,从定位群体亲本Rs1046A和19514A中分离出候选区段内的大部分序列及部分目标拷贝特异的标记。利用上述标记锚定的长片段PCR(以预测的全长基因为单位)成功的从两亲本中分别克隆到包含ORF4、ORF5、ORF6、ORF7和ORF8完整基因的序列。5.候选基因的遗传转化与功能互补。将上述分离的各候选基因片段分别克隆到表达载体pFGC5941中构建互补载体,采用农杆菌介导的方法转化相应的受体材料(全不育系或临保系)。对T0代阳性单株的表型鉴定表明,从恢复系亲本19514A中分离到的一个候选基因ORFna能够恢复全不育系的育性；阳性单株自交的T1代育性观察发现该转基因与育性恢复共分离,证实ORFna就是BnMs5位点的恢复基因BnMs5a。