MiR-200c-3p/RIP2/NF-κB调控LPS诱导的BV2小胶质细胞活化的作用机制研究

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目的:神经胶质瘤是原发于中枢神经系统的恶性肿瘤,预后极差。目前针对胶质瘤的治疗方法包括手术切除、术后放化疗等,均效果欠佳。近年来,为了寻找神经胶质瘤更加有效地治疗策略,人们逐渐将目光聚焦于肿瘤炎性微环境的研究。小胶质细胞作为神经胶质瘤微环境的重要组成部分,其在胶质瘤发生发展中所扮演的重要作用越来越受到重视。通过特定靶点干预从而将小胶质细胞表型转换为免疫监视的抗肿瘤表型,正逐渐成为目前胶质瘤靶向治疗的研究热点。已有研究表明,miR-200c-3p和受体相互作用-2(RIP2)在免疫反应中发挥重要作用。然而,两者在小胶质细胞活化过程中的作用尚不明确。本研究将分两个部分对miR-200c-3p/RIP2/NF-κB信号通路在LPS处理的BV2小胶质细胞激活过程中调节其炎症反应的作用机理进行探讨:(1)miR-200c-3p在LPS处理的BV2小胶质细胞激活过程中的作用研究;(2)miR-200c-3p通过靶向RIP2影响NF-κB信号通路激活从而抑制小胶质细胞活化的作用机制研究。通过以上研究内容,可能为实现胶质瘤微环境下小胶质细胞的抗肿瘤向转换、研发更加有效地靶向治疗药物提供实验基础。方法:第一部分1.以预设浓度0、10、100和1000 ng/ml的LPS(脂多糖)分别在不同时间点0、4、12和24 h处理BV2细胞诱导其激活。采用real-time聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)(PCR)检测miR-200c-3p在BV2细胞中的表达水平。2.以miR-200c-3p模拟物转染BV2细胞后,再用LPS对BV2细胞进行干预。采用流式细胞术检测BV2细胞CD86阳性细胞(M1极化BV2细胞特异标记)的百分比,分析BV2细胞活化情况;采用real-time PCR检测分析处理后的BV2细胞内诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synase,i NOS)和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex class,MHC)-Ⅱ的m RNA表达水平。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测分析白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等炎症细胞因子的释放水平。采用免疫荧光染色检测分析各处理组细胞核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)p65的表达的细胞核定位情况,采用蛋白印记分析(western blot)检测分析NF-κB p65的细胞核表达水平和磷酸化水平。第二部分1.通过网站预测受体相互作用蛋白2(RIP2)可能作为miR-200c-3p的靶基因。利用双荧光素酶报告基因检测证实miR-200c-3p和RIP2两者之间的关系。以miR-200c-3p模拟物转染BV2细胞,通过real-time PCR和western blot检测RIP2的表达水平。2.筛选制作两个靶向RIP2的siRNA,分别命名为RIP2 siRNA1和RIP2siRNA2。通过real-time PCR和western blot检测siRNA的转染效率。选择一种转染效率高的RIP2 siRNA转染BV2细胞,再用LPS对BV2细胞进行干预。采用流式细胞术检测分析CD86阳性细胞的百分比;采用real-time PCR检测分析处理后的BV2细胞内i NOS和MHC-II的m RNA表达水平;采用ELISA试剂盒检测分析IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症细胞因子的释放水平;采用western blot检测分析NF-κB p65的细胞核表达水平和磷酸化水平。3.采用miR-200c-3p模拟物、RIP2过表达质粒(RIP2 OE)(RIP2 CDS克隆)共转染LPS处理的BV2细胞。以流式细胞术、ELISA、Real-time PCR和western blot等方法检测分析BV2细胞活化情况以及促炎细胞因子释放的变化情况,以及在LPS诱导的BV2细胞活化过程中NF-κB p65核移位情况和磷酸化水平。结果:1.经预设阶梯浓度LPS处理后,BV2细胞中miR-200c-3p表达显著下调,且呈剂量依赖性(P<0.05)。以10 ng/m L LPS处理,不同时间点LPS处理后的细胞中miR-200c-3p m RNA的表达水平均显著降低(P<0.05),且表现出时间依赖性。2.LPS处理增加小胶质细胞M1表型特异标志物i NOS和MHC-Ⅱ的表达,促进促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放,NF-κB p65的磷酸化和核易位(P<0.05)。相反,miR-200c-3p模拟物转染后则明显下调了i NOS和MHC-II m RNA的表达水平(P<0.05),降低了炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放水平(P<0.05),抑制了NF-κB p65核移位,并使其磷酸化水平显著降低(P<0.05)。这些数据表明miR-200c-3p能够抑制LPS处理的BV2小胶质细胞的M1极化。3.发现RIP2是miR-200c-3p的直接靶点。miR-200c-3p可直接与RIP2的3’非翻译区(Untranslated Regions,UTR)结合,调控RIP2在BV2细胞中的表达。4.敲低RIP2与miR-200c-3p模拟物有相似作用。RIP2 siRNA在LPS处理的BV2细胞中显著降低了CD86阳性细胞的百分比(P<0.05),RIP2siRNA转染后明显下调了细胞内i NOS和MHC-II m RNA的表达水平(P<0.05),显著降低了炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放水平(P<0.05),抑制了NF-κB p65核移位,并使其磷酸化水平显著降低(P<0.05)。数据表明,敲低RIP2能够抑制LPS处理的BV2小胶质细胞的M1极化。5.miR-200c-3p模拟物和RIP2过表达显著提高LPS处理的BV2细胞中CD86阳性细胞的百分比(P<0.05),显著增加了促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量(P<0.05),明显增强了p65核移位和磷酸化水平(P<0.05)。结果表明,miR-200c-3p通过靶向RIP2进而影响NF-κB信号通路激活从而抑制LPS处理的BV2小胶质细胞的激活。结论:1.miR-200c-3p通过抑制NF-κB信号通路激活从而抑制LPS处理的BV2小胶质细胞的M1极化。2.RIP2是miR-200c-3p的直接靶点。3.敲低RIP2可抑制NF-κB激活并抑制BV2小胶质细胞的M1极化。4.miR-200c-3p通过靶向RIP2而影响NF-κB信号通路激活从而抑制LPS处理的BV2小胶质细胞的激活。5.miR-200c-3p/RIP2/NF-κB信号通路可能是治疗神经炎症相关疾病的潜在治疗靶点。
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