背景:　　 单纯疱疹病毒2型(HSV2)是单纯疱疹病毒的一个亚型,为人类易感病毒,是严重威胁人类健康的常见病原体之一。它不仅可引起生殖系统感染,还可导致严重的非典型性疾病及神经系统疾病,如新生儿致命性脉络膜炎,脑膜脑炎及成人脑膜炎。HSV2还可增加患者对人类缺陷型病毒的易感性。VP16即包膜蛋白的一种,由晚期基因ULA8编码。VP16在病毒复制周期的晚期表达,启动HSV基因的级联转录反应。作为多功能病毒蛋白,VP16不仅是病毒裂解性感染的主要因子,在病毒从潜伏期重新激活过程中也起关键作用。在裂解期,VP16可传送至下一个宿主细胞并通过聚集YP16诱导复合体激活立早期基因的转录。RNA干扰(RNAi)是多数真核细胞用双链RNA分子(dsRNA)特异性调节基因活动性的一种调节机制。目前应用的RNAi技术包括两种基本策略。一种以RNA为基础,应用化学合成的siRNA;另一种以DNA为基础,构建携带shRNA的载体,从而构建稳定表达siRNA的细胞系。与化学合成的siRNA相比,后一种可长时间沉默基因表达。　　 目的:　　 本研究旨在应用以DNA为基础的RNAi技术,建立稳定表达靶向HSV2 VP16shRNA的vero-shRNA细胞系。并研究其对VPl6表达的抑制能力,及VP16表达下调对HSV2复制能力的影响。　　 方法:　　 首先,构建携带靶向HSV2 VP16基因shRNA的慢病毒载体质粒plko-shRNA。经PCR及测序鉴定正确后,与慢病毒辅助蛋白质粒△8.2和慢病毒包膜蛋白质粒VSV-G共转染慢病毒宿主细胞293T细胞。48小时以后,收集培养皿中培养液,用0.45μ m滤膜孔径的一次性针头滤器过滤,即可获得病毒原液。病毒原液于25000rpm4℃超速离心90分钟以后,弃掉上清液,用1m1PBS重悬,即可得病毒浓缩液。测病毒滴度后,复苏vero细胞,等到细胞长至70％时,于其中四孔加入重组慢病毒virtls-plko-shRNA,剩下的两孔中加等量的无菌PBS,以作为阴性对照。细胞经过8μg/ml嘌呤霉素抗性筛选,挑选同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的单细胞克隆继续扩大培养。即建成vero-shRNA24,vero-shRNA642与shRNA阴性对照vero-shCON细胞系。细胞分组情况如下:A:Vero,B:Vero-shCON,C:Vero-shRNA24,D:Vero-shRNA642,E:Vero-shRNA24+642。HSV2感染各组细胞后,应用实时荧光定量PCR检测,根据Ct值计算VP16 mRNA相对表达量和shRNA抑制率。用同样的方法分别测定第10,20与50代子细胞系对HSV2 VP16的抑制率。HSV2病毒感染各vero-shRNA细胞系,24小时后观察各组细胞的CPE情况,通过计算每孔中病变细胞,即融合,挛缩,肿胀,脱壁及死亡细胞的比例,评估细胞CPE率。为检测其对HSV2病毒复制能力的影响,感染HSV-2的各组细胞系分别于感染后24,48,72,84,96小时取样,病毒产量减少实验测定子代病毒滴度,并绘制病毒一步生长曲线。用同样的方法分别测定第10,20与50代子细胞系对HSV2子代病毒滴度的影响。　　 结果:　　 经测序鉴定,成功构建慢病毒载体plko-shRNA24,plko-shRNA642与plko-shCON。分别与慢病毒辅助蛋白质粒△8.2和慢病毒包膜蛋白质粒VSV-G共转染慢病毒宿主细胞293T细胞后,获得重组慢病毒。感染vero细胞后,经过三轮嘌呤霉素筛选与GFP表达阳性筛选,挑取嘌呤霉素抗性,且GFP表达阳性的单细胞克隆,扩大培养,即成功构建vero-shRNAs细胞系,根据所表达shRNA不同,分别命名为vero-shRNA24,vero-shRNA642和阴性对照vero-shCON。检测时,一组将以veto-shRNA24和vero-shRNA642等比例混合培养,称为vero-shRNA24+642。首先,应用实时定量PCR检测vero-shRNAs对细胞内VP16mRNA表达的抑制效率。以MOI=1的HSV2感染各组细胞后,与vero细胞相比,vero-shRNA24, vero-shRNA642和vero-shRNA24+642可明显减少VP16 mRNA的表达(P＜0.05)。而vero-shCON中VP16mRNA的表达与vero细胞无明显差异。其中,Vero-shRNA24最为有效,感染24小时后,其抑制率为90.55%;为了解靶向VP16的vero-shRNA对HSV2病毒复制能力的影响,分别用MOI=5,1,0.05三种不同滴度的HSV2病毒感染各组细胞。24小时后,观察受感染细胞的CPE情况,而后收集细胞及细胞上清液,检测病毒滴度。MOI=5:A组与B组中80%的细胞达CPE。C组细胞中40%达CPE。D组中CPE细胞占50%,E组中CPE细胞少于50%;MOI=1:A组与B组中,将近40%的细胞产生CPE。C组15%的细胞产生CPE。D组达CPE的细胞占15%。而D组和E组中,产生CPE的细胞分别占20%和18%;MOI=0.05:A组和B组中,30%细胞产生CPE。C组CPE细胞占5%。D组和E组,CPE细胞接近10%。各组细胞感染MOI=0.05的HSV2病毒后,为检测vero-shRNAs对子代病毒滴度的影响,用病毒产量减少试验测定子代病毒滴度。感染24小时后,与vero细胞相比,vero-shRNACON对子代病毒滴度无影响。Vero-shRNA24, vero-shRNA642和vero-shRNA24+642细胞系可使子代病毒滴度分别下降2 log10,1 log10,和1.4 log10。病毒感染72小时内,各vero-shRNAs的抑制能力持续上升。感染72小时后,与vero细胞组相比,vero-shRNA24, vero-shRNA642和veto-shRNA24+642细胞系可使子代病毒滴度分别降低310g10,210g10,2.410g10。而Vero和Vero-shCON组的病毒滴度在72小时达到最高,而后病毒滴度开始下降。然而vero-shRNAs组的病毒滴度在感染后84小时达到高峰。高峰时期病毒滴度低于vero及vero-shCON病毒高峰滴度。从所绘制病毒一步生长曲线可看出,病毒不仅数量减少,且复制速度变慢,达峰时间延长;通过荧光实时定量PCR检测感染HSV2病毒24小时后,原代veto-shRNA24细胞以及其第10,20及50代细胞对HSV2 VP16的抑制效率,研究细胞传代对其抑制能力的影响。原代细胞的抑制率为91.21%,第10代和第20代的抑制率分别为90.59%和90.04%,与原代细胞相比,无统计学差异。虽然没有统计学意义,第50代细胞的抑制能力稍有减弱,其抑制效率为87.93%。为研究细胞传代对vero-shRNAs细胞系抑制病毒复制能力的影响。接种MOI=1的HSV2病毒24小时后,测定原代细胞系,及vero-shRNA24第10代,第20代及第50代细胞系内病毒滴度。第10代细胞可使子代病毒降低2log10,第20代细胞和第50代细胞可分别使子代病毒降低1.9log10 and1.510g10。与原代细胞相比,均无统计学差异。　　 结论:　　 本研究成功构建表达靶向HSV2 VP16 shRNA的重组vero-shRNAs细胞系。Vero-shRNAs可有效的抑制病毒内VP16mRNA的表达。VP16mRNA表达水平的降低有效抑制了HSV2病毒的侵袭能力及复制能力。在50代以内,重组细胞系vero-shRNAs均可有效的抑制VP16mRNA的表达,从而影响HSV2病毒的复制,其抑制能力与原代细胞相比,无明显差异。