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植物内生真菌(Endophytic fungi)是一类在植物体内完成其部分或全部的生活史,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。植物内生真菌中开展研究最早、最多的是冷季型禾本科植物中的Epichloe(Fr.)Tul.属及其无性型的Neotyphodium Glenn,Bacon&Hanlin属真菌(现统称为epichl06内生真菌)。在与宿主植物长期的共同进化过程中,Epichloe属内生真菌与宿主植物形成了一种互利共生的关系(Mutualistic),给植物带来优异的促生长、增加分蘖、抗病虫、抗食草动物等特性。因此,该属真菌作为一类新型的微生物资源被广为研究。
Epichloe属真菌是子囊菌门(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreales)麦角菌科(Clavicipitaceae)的一类真菌,含有6个欧洲种和4个北美洲种,在亚洲一直没有新种的发现。本研究以我国东部长江中下游地区发现的长有真菌子座的鹅观草属禾本科植物为材料,从中分离得到了典型的Epichloe属内生真菌菌株,对此进行了较为系统的分类学研究。
首先,本研究对我国长江中下游地区的江苏、浙江、安徽、湖北和湖南等5省,包括南京、无锡、扬州、杭州、合肥、武汉和长沙等7市的禾本科植物进行了采样调查。从以上地区的18个地点发现了大量的分蘖上长有真菌子座的鹅观草属植物(Roegneria spp.)群落。真菌子座圆柱状,初期白色,成熟后变黄;子囊壳梨形,高205-275μm,宽90-140μm;子囊柱状,(189-252)×(5.0-5.3)μn;子囊孢子无色透明,丝状,(183-250)×(1.9-2.1)μm,萌发时有隔膜,不分节。根据形态特征,这些形成子座的真菌被初步鉴定为Epichloe属真菌。研究发现我国的Epichloe-Roegneria组合在长江中下游地区分布比较广,资源丰富。
第二,对上述禾本科植物样品进行了分离。从中分离到77株真菌菌株,对这些菌株进行了形态学研究:在PDA培养基上25℃培养3周,菌落直径20-79mm,正面白色,棉质,质地紧密,中央隆起或稍有皱褶,背面黄色至深褐色,产生大量的分生孢子。分生孢子无色透明,舟形或肾形,单个顶生,(4.9±0.6)×(2.8±0.7)μm;分生孢子梗长16.5-30.6 μm,基部宽22-3.1 μm,顶端变尖,为典型的Epichloe属真菌的形态结构。研究发现我国的Epickloe菌株与国外报道的菌株在形态学特征上有明显的差别,同时,我国菌株之间在形态上也存在一定的多样性。
第三,选择1 3个代表性菌株,利用SDS法提取了它们的总DNA。采用RAPD-PCR
的方法,分析了这13个Epichloe(属菌株与9个Neotyphodium属菌株之间的亲缘关系。结果显示,分离自我国的内生真菌菌株具有丰富的遗传多样性;菌株的亲缘关系与宿主植物、采集地点也具有一定的相关性;我国的菌株可能是不同于国外菌株的新类群。第四,对分离自我国鹅观草(R.kamoji)中的6株Epichloe属真菌菌株的tub2和tefl基因序列进行了克隆测序,并对该属内所有已经建立的种进行了系统发育分析。结果表明我国的6株菌株间的tub2和,tefl基因序列相似度很高;一对测得的序列进行Blast搜索,搜索结果全部为epichloe内生真菌的序列;同时,根据tub2和tefl基因序列构建的系统发育树显示,我国的菌株形成一个单独的分枝,和E.bromicola的种群比较接近。这些数据提示了建立新种的必要性。
第五,将分离自我国鹅观草(R.kamoji)中的Epichloe属真菌菌株分别和与之系统发百学上近缘的E.bromicola以及宿主植物近缘的E.elymi的模式菌株进行了杂交实验,分析了我国菌株的交配类群及交配型。实验结果表明:我国的菌株之间杂交可育,具有相容性,属于同一个交配类群;我国的菌株与E.elymi和E.bromicola菌株之间不具有杂交相容性,我国的菌株很可能属于一个新的交配类群,暂时定名为MP-X。同时,还确定了我国部分菌株的交配型,为以后的杂交实验奠定了基础。
最后,根据分离菌株的形态学特征、宿主植物特异性及地理分布、交配类群和系统发育学信息,本研究以我国鹅观草属植物(Roegneria spp.)中的Epichlog属真菌为模式菌株,建立了Epichloe属的一个新种,命名为Epichloe yangzii W.Liet Z.W. Wang,sp.nov.。这是我国本土发现的Epichloe属的第一个新种,也是亚洲发现的第一个新种。