促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor, CRF)家族肽包括4个成员,即CRF, Urocortin (Ucn), Urocortin2 (Ucn2)和Urocortin3 (Ucn3)。 CRF家族肽广泛地分布于中枢神经系统和外周系统。CRF家族肽通过CRF1型受体(CRF receptor type 1, CRFR1)和CRF2型受体(CRF receptor type 2, CRFR2)调节多种类型细胞的迁移、增殖和凋亡,这两种亚型受体都属于G蛋白偶联受体。Ucn是一个由40个氨基酸组成的多肽。有研究表明,在缺血再灌注的心肌细胞中,Ucn通过抑制Beclinl的表达从而抑制自噬。然而,Ucn对人乳腺癌细胞自噬的作用及其机制尚无报道。在正常情况下细胞的基础自噬水平很低,因此本部分使用Earle’s平衡盐缓冲液(Earle’s balanced salt solution, EBSS)饥饿诱导细胞发生自噬。然后,通过透射电子显微镜(TEM)观察自噬体从而检测细胞的自噬活性。TEM结果显示,EBSS饥饿的细胞中形成了双层膜的自噬性囊泡,表明EBSS能诱导细胞发生自噬。此外,通过检测构成自噬体的重要成分P62 (P62/sequestosome-1,一种泛素样结合蛋白)和微管相关轻链蛋白3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)的表达水平从而衡量细胞的自噬活性。本实验的研究对象为人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7细胞)。本部分主要研究了Ucn对饥饿诱导的乳腺癌细胞自噬的作用及其相关机制。蛋白免疫印迹和慢病毒GFP-LC3转染的结果表明,在饥饿诱导的乳腺癌细胞自噬中,Ucn升高了P62蛋白的水平,然而降低了LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值和GFP-LC3斑点的数量。为了明确Ucn是否通过CRF受体影响自噬,本实验使用了非选择性CRF受体阻断剂Astressin (Ast),结果发现Ast阻断了Ucn对饥饿诱导自噬的作用,这表明Ucn是通过CRF受体发挥对细胞自噬的抑制作用。接下来,本部分进一步探究Ucn降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的原因,众所周知,自噬体的形成和溶酶体的降解都能影响LC3B-Ⅱ水平的变化。因此有必要弄清Ucn降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值是由于Ucn减少了自噬体的形成,还是由于Ucn增加了自噬体的降解。实验中使用了自噬溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1, BafA1),单独给予BafAl明显地增加了GFP-LC3斑点的数量；与单独给予BafAl相比,联合给予Ucn和BafAl则显著地减少了GFP-LC3斑点的数量。这些结果表明：Ucn是通过减少自噬体的形成从而降低LC3B-Ⅱ /LC3B-Ⅰ的比值。此外,由于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)激酶是自噬过程中的一个重要的调控因子,因此,本部分进一步研究了Ucn对mTOR磷酸化水平的影响,结果发现Ucn几乎不影响两种乳腺癌细胞的mTOR磷酸化水平,这表明mTOR通路可能不参与Ucn对饥饿诱导的自噬的作用。综上所述,Ucn通过与CRF受体结合从而减少自噬体的形成,最终抑制饥饿诱导的乳腺癌细胞自噬。此外,mTOR通路可能不参与Ucn对饥饿诱导的乳腺癌细胞的自噬作用。