蛋白质是生命活动的主要承担者,广泛的参与机体的各项生理过程。蛋白质的动态学特征对其行使相应的功能具有非常关键的作用,获得蛋白质高分辨率的结构和动态信息对于理解其运行机制具有重要的指导意义。目前用于蛋白质动态结构研究的实验手段主要包括核磁共振,荧光光谱等技术。荧光光谱用于研究蛋白质动态结构最常用的方法是荧光共振能量转移(FRET),利用荧光基团之间能量传递的效率与距离的关系,可以得到标记位点之间的距离约束,用于蛋白质结构计算。因为除了荧光蛋白以外,一般蛋白质并没有好的荧光性能,因此进行荧光共振能量转移的一个前提是需要对蛋白质进行荧光标记。在活细胞水平上对蛋白质进行荧光标记最常用的手段是将荧光蛋白融合表达在目的蛋白的末端,然而荧光蛋白嵌入蛋白后,往往会对目标的蛋白的可溶性造成影响,或者荧光蛋白本身难以正确折叠。另外一个问题是荧光蛋白本身成熟发光需要一定的时间,往往以小时计,因此发展对目的蛋白结构和功能影响小的快速荧光标记方法非常必要。顺磁核磁包括顺磁弛豫增强(PRE)和赝接触化学位移(PCS)等,其基本原理是利用未成对电子与原子核之间偶极偶极相互作用从而得到长程的几何约束。进行顺磁核磁的前提需要对蛋白质进行顺磁标记,标记的刚性直接决定了所计算结构的精细程度,因此发展能够特异性定点标记的刚性顺磁探针显得尤为重要。基于以上的科学问题,在荧光标记探针的发展方面,本论文设计了一种基于split-GFP的全新的细胞表面膜蛋白的荧光标记方式。从结构出发,将超折叠绿色荧光蛋白sfGFP拆分为两部分,将其桶状结构中的第10和第11条β-strand(GFP10-11)融合表达于目标蛋白的胞外区域,另一方面,通过全长sfGFP酶切制备得到由第1到9条β-strand组成并包含成熟生色团的GFP1-9"帽子",通过GFP10-11和GFP1-9的结合实现荧光从off到on的过程,从而实现活细胞水平上细胞表面膜蛋白荧光的标记。通过这一全新的荧光标记手段,我们研究了 G蛋白偶联受体GPR17和半胱氨酰白三烯受体CysLT2R的内化行为,发现这两种G蛋白偶联受体都会发生内化,从细胞膜进入到细胞质中。在顺磁标记探针的发展方面,基于小分子螯合剂DTPA骨架,本论文设计了DTTA-C3和DTTA-C4两种通过点击反应连接的刚性顺磁探针,该两种探针具有非常好的对称性,我们通过调节连接基团和镧系金属螯合基团之间碳原子的个数对探针的刚性进行了优化。通过密码子扩展的方式在蛋白质的特定位点引入带有叠氮基团的非天然氨基酸后,结合点击化学反应,在蛋白质的特定位点引入顺磁标记,这种顺磁标记的方式可以解决传统的通过半胱氨酸连接的探针要求蛋白质表面有且仅有一个半胱氨酸的问题,从而可用于含多个半胱氨酸的蛋白质体系的研究。我们对新发展顺磁探针的性质进行了表征,相比于目前已经报道的同类型探针,DTTA-C3探针具有最好的刚性。运用该探针产生的PCS约束,我们成功解析了瞬态相互作用复合体UBA1-Ub的结构。进一步,本论文结合单分子荧光共振能量转移和顺磁核磁共振等多种生物物理方法,对RSV(Rous Sarcoma Virus)衣壳蛋白在溶液中的动态结构进行了研究。通过单分子荧光共振能量转移(smFRET)提供的距离分布信息从而得到多态的比例信息,结合顺磁核磁提供的几何约束信息,我们拟计算RSV衣壳蛋白在溶液中两态的系综结构。在此基础上,我们试图阐明多态分布的结构基础和多态结构与衣壳蛋白组装的关系,并最终弄清逆转录病毒组装机制。综上所述,本论文围绕蛋白质动态结构和功能研究的探针开发方面发展了一种用于活细胞表面G蛋白偶联受体的荧光标记方法,并通过该方法确定了两种G蛋白偶联受体GPR17和CysLT2R的内化行为;其次,发展了两种通过点击化学反应连接的刚性顺磁探针,并通过该顺磁探针的标记结合顺磁核磁的实验方法解析了瞬态复合物UBA1-Ub的复合体结构,获得了精细的动态结构信息。围绕蛋白质动态结构和功能的研究方面,论文结合单分子荧光共振能量转移技术和顺磁核磁共振的方法,试图解析RSV衣壳蛋白在溶液中的多态结构,并尝试阐明逆转录病毒衣壳蛋白的组装机制。