【摘 要】
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第一部分:结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗,并对其在体外真核细胞及C57BL/6小鼠中表达,初步探究这两种DNA疫苗的免疫原性。方法从Gen Bank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列送生工合成。然后
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第一部分:结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗,并对其在体外真核细胞及C57BL/6小鼠中表达,初步探究这两种DNA疫苗的免疫原性。方法从Gen Bank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列送生工合成。然后经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,测序鉴定正确后应用TIANGEN试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答,流式检测升高细胞因子所属细胞亚型。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗在体内外均能表达。体外Western Blot检测显示,DNA疫苗体外转染293T细胞24h可以检测到蛋白Hsp65、Ag85B、ESAT6的表达,48h时细胞内蛋白表达量达最高。C57BL/6小鼠中Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗激起了很好的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗都具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答;Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力比Hsp65-ESAT6 DNA疫苗强,有待进一步研究其应用价值。第二部分:卡介苗ure C基因缺失株的构建及筛选目的在MTB中ure C产生的氮被认为是碱化MTB生存微环境的重要来源,不仅可以预防吞噬体的酸化,还可阻止吞噬体和溶酶体的融合,进一步逃脱免疫监视和免疫反应。运用Cre/Lox P同源重组方法对卡介苗进行遗传操作,缺失卡介苗中氮源基因ure C,打破MTB在体内原有适宜生存的微环境,促进吞噬-溶酶体成熟,筛选并获得卡介苗ure C基因缺失株,为后续在此缺失株添加有效的MTB免疫抗原提供基础。方法采用Cre/Lox P同源重组的方法,将含有重组酶的p SL002质粒电转至卡介苗中,涂板,长出单菌落后以此菌落做感受态。利用speⅠ和NsiⅠ双酶切本实验室前期构建的含有ure C基因左右同源臂及gfp荧光蛋白的重组质粒p SL001,获得目的片段,并将其电转至上述含有p SL002质粒的卡介苗,涂板后挑取单克隆,通过菌液PCR进行鉴定、筛选出卡介苗中双交换目的片段并缺失ure C基因的菌株,从而获得卡介苗ure C基因缺失株。结果电转至含有p SL002质粒卡介苗的目的片段,因为存在gfp蛋白,在蓝光手电筒下发绿色荧光,包括单交换与双交换两种,对发绿色荧光单菌落进行菌液PCR,琼脂糖凝胶鉴定,单交换菌落在1734bp处出现条带,双交换菌落因片段过大在3498bp处隐约有条带或不出现条带。挑取双交换菌落涂板传代,成功筛选出了卡介苗ure C基因缺失株,形态正确,并能够稳定传代。结论利用Cre/Lox P同源重组方法在卡介苗中进行遗传操作,能够对卡介苗的基因进行无缝敲除,并且获得的突变株能够稳定传代。研究表明,在此过程中采用Cre/Lox P同源重组系统可大大提高了MTB的重组效率并缩短了重组时间,为重组卡介苗的研究提供了便利。
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