沙冬青属豆科沙冬青属,是古老的第三纪残遗种,为亚洲中部荒漠地区特有的常绿阔叶灌木,具有极强的抵御低温、干旱、盐、高温胁迫的能力,是一种理想的抗逆基因资源植物。但目前对沙冬青的研究主要停留在生理及植被保护方面,对其抗性分子生物学机理方面的研究较少。据此,我们以沙冬青为材料,对其非生物胁迫相关基因的功能进行了较为系统的研究,探讨沙冬青抗逆机理,从而为抗逆品种选育提供数据和技术支持,同时也期望为通过基因工程技术培育抗逆植物新品种提供新的基因资源。本文的主要研究结果如下：1、沙冬青KS型类脱水素基因AmCIP及其基因家族功能分析及鉴定1.1沙冬青KS型类脱水素AmCIP的低温保护功能鉴定AmCIP编码的脱水素中含一个富K区域(HKEGLVDKIKDKVHG),与典型的脱水素K区(EEKKGIMDKIKELPG)有所不同。AmCIP还含有一个S区,但是不含有Y区,因此我们将其命名为KS型类脱水素。本研究的结果显示：转AmCIP烟草的抗寒性获得提高；在E. coli ER2566中超表达AmCIP能增强宿主菌抵御冻融伤害的能力；纯化得到的重组AmCIP是水溶性的蛋白,并具有热稳定性；重组AmCIP能在冻融胁迫下保护乳酸脱氢酶的活性；YFP/AmCIP融合蛋白定位在洋葱内表皮细胞的细胞质和细胞核中。因此推测沙冬青KS型类脱水素AmCIP可能在沙冬青细胞质和细胞核中发挥作用,并与沙冬青低温防御机制密切相关。1.2沙冬青KS型类脱水素基因家族的克隆与序列和功能分析根据AmCIP序列设计引物,从低温、干旱、盐、高温胁迫处理的沙冬青中扩增得到一组与AmCIP同源性很高的基因。它们编码的蛋白长106至290个氨基酸残基,这些蛋白与AmCIP的同源性也很高,加上AmCIP共计为126个。我们对这些蛋白采用AmP+氨基酸残基数+字母的命名方式。经过分析,这些蛋白的分子量从11.661 kDa到30.688kDa不等。每个蛋白中所含的甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺以及组氨酸占氨基酸总数的60%以上,其中甘氨酸的含量最高。除AmP200P为碱性蛋白外,其余蛋白均为酸性蛋白。这些蛋白具有33个氨基酸残基长的保守N端和71或73个氨基酸残基长的保守C段,在这两段保守序列之间有0-8个22或24或26个氨基酸残基长的重复片段,这些重复片段之间也具有较高的同源性。这些蛋白在保守的C端区域中都含有一个15个氨基酸残基长的富含K的,与典型脱水素K片段类似的区域,并且这些蛋白还都具有一个S片段,但是不存在Y片段,因此我们称这个家族为沙冬青KS型类脱水素家族。这些蛋白均为亲水性蛋白,并含有3-11个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和1-16个N-肉豆蔻酰化位点,推测这些类脱水素可能在沙冬青细胞中参与细胞信号转导活动。另外,某些蛋白还含有RGD细胞附着序列。这些蛋白都有较高比例的柔性区域。这些蛋白内部亲缘关系很近,与4种低温响应的脱水素亲缘关系最近,包括鬼箭锦鸡儿(Caragana jubata)AEJ20970.1,棘豆(Oxytropis campestris subsp.johannensis) AEV59620.1和AEV59619.1,以及棘豆(Oxytropis arctobia)AEV59613.1。用纯化的重组AmCIP溶液制备抗血清,用此抗血清对低温、干旱、盐、热胁迫处理的沙冬青进行免疫印迹分析。结果显示,沙冬青KS型类脱水素家族在正常生长条件下的沙冬青中的表达水平很低,但是受低温、干旱、盐、热胁迫信号的诱导,并随着胁迫处理时间的延长表达量也逐渐升高。根据以上结果推测,此沙冬青KS型类脱水素家族可能参与了沙冬青的非生物胁迫防御机制。在此之前尚未有研究发现具有类似特点的大型脱水素家族,沙冬青KS型类脱水素家族的发现可以为脱水素的分子进化以及沙冬青独特的抗逆机理研究提供宝贵的理论基础。2、沙冬青防御素基因AmDF的功能鉴定沙冬青防御素基因AmDF全长414 bp,含有一个207 bp编码68个氨基酸的开放阅读框,推测编码的蛋白分子量为7.66 kDa,等电点为8.92,包含8个保守的半胱氨酸残基可以形成4对二硫键。蛋白内含有一个Knot1结构,这是具有抗菌活性的γ-硫堇(γ-thionin)和Knottin中常见的结构。此编码蛋白与大车前(Plantago major)防御素CAH58740.1的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,AmDF在正常生长条件下的沙冬青中表达水平较低,然而其表达量在低温、干旱、盐以及热胁迫条件下表达量都出现上调,并且主要在低温胁迫后期富集。YFP/AmDF融合蛋白定位在洋葱内表皮细胞的细胞质和细胞核中。然而转AmDF烟草的抗低温、干旱、盐胁迫能力未获得提高。因此推测沙冬青防御素AmDF可能参与低温胁迫下对外界环境中病原体的抵御活动,从而提高沙冬青在低温胁迫下的存活率,不过这还需要进一步实验进行验证。3、沙冬青非生物胁迫抗性相关功能基因表达分析3.1沙冬青非生物胁迫下荧光定量内参基因选择植物对逆境条件的反应不取决于某一单个因子,而是大量基因协同作用的结果。对某一个基因、或某一类基因的功能进行分析,难以完整解释性状的表现机理,而对表达的基因进行综合的研究则有利于揭示植物性状的复杂分子本质。为了探索基因某方面的功能,首先就要了解其在植物体内的表达。实时荧光定量PCR具有准确、灵敏、重复性好、通量高等优点,而被研究者广泛应用于基因的表达分析。为了去除不同样本在RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差别,以得到可靠的目标基因的表达水平和表达模式,选取合适的内参基因显得尤为重要。本研究第一次对沙冬青低温、干旱、盐、高温胁迫下荧光定量内参基因的选择进行了系统的分析。利用geNorm和NormFinder两个软件对14个内参候选基因在22个沙冬青样品(包括对照1个,低温、干旱、盐胁迫各5个,热胁迫6个)的表达稳定性进行分析后发现,eIF1和eIF3在22个沙冬青样品中表达稳定性最高,Tub2、Abc1和EF1的表达稳定性最低。通过对AmHsp90的表达进行分析,证明了geNorm和NormFinder两个软件给出的候选基因的排名都是可靠的。3.2沙冬青非生物胁迫相关功能基因在低温、干旱、盐以及热胁迫下的表达分析采用qPCR分析方法,用eIF1和eIF3作为内参,对沙冬青中55个胁迫相关的功能基因,包括AmSOD01～04、AmCAT01、AmAPX01、AmAPX02、AmGPX01、AmPrx01、AmPrx02、AmTrx01～06、AmFNR01、AmFd01～04、AmGrx01～05、AmHsp70-1～3、AmHsp90-1、AmDnaJ01、AmDnaJ02、AmLEA01、AmLEA14、AmLOX01、AmLOX02、Am1433-01～03、AmCAB01～07、AmFBP01～02、AmFBA01、AmEno01、AmPGK01～02、AmMT01～03、AmFer01在低温、干旱、盐以及热胁迫处理后的沙冬青中的表达情况进行分析。表达结果显示这些基因在正常生长条件下的沙冬青中都有表达,说明它们可能为沙冬青在正常生长条件下维持生理代谢所需要的基因。然而它们的表达大多受胁迫信号调节,在表达水平和表达模式上具有各自的特点。抗氧化相关基因在低温、干旱、盐以及热胁迫的各阶段都出现不同程度的上调,说明沙冬青对氧化胁迫有较强的控制力。光合作用相关的AmCAB01～07以及糖异生和糖酵解相关的AmFBP01～02、AmFBA01、AmPGK01～02和AmEno01在非生物胁迫的后期都出现降低,说明沙冬青为了适应长期的恶劣环境,可能在胁迫后期的降低自身对能量和同化物的需求。其余基因也在在胁迫处理的不同阶段出现了上调或下调的现象。推测这些基因可能对沙冬青胁迫防御机制的建立起到积极的作用。这些基因表达模式的多样性,也说明了植物逆境胁迫响应机制的复杂性。总之,经过长期的地质历史时期的适应性进化,沙冬青获得了在沙漠极端恶劣条件下生存的策略,进化得到一些自身特殊的分子防御机制。本研究的成果对沙冬青强抗逆机制的研究提供了重要的实验和理论基础,同时也为农作物和树木抗逆品种的选育提供了许多可供选择的胁迫基因。