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背景:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是东南亚地区具有高发病率的头颈部恶性肿瘤,局部复发和远处转移是临床治疗失败的主要原因。针对这类标准治疗失败或复发转移的鼻咽癌患者,临床常以化疗为主,但易产生耐药性。鼻咽癌耐受放疗及化疗的主要原因是抵抗细胞凋亡。与常见的细胞死亡方式如凋亡、坏死和自噬不同,坏死性凋亡(Necroptosis)是由受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIPK1)/受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIPK3)/混合系激酶区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导的,具有坏死细胞的形态学特征。研究发现,坏死性凋亡同细胞凋亡一样受细胞内信号因子的周密调节,RIPK1和RIPK3是其关键的调控因子,RIPK3主要通过形成称作为“necrosome”的RIPK1-RIPK3促坏死复合物来实现对坏死性凋亡的调控。研发能够诱导鼻咽癌细胞发生坏死性凋亡的新药,对克服鼻咽癌化疗中凋亡抵抗至关重要。紫草素即是中草药紫草中提取出的一种小分子萘醌类化合物,已有研究发现紫草素能够诱导脑胶质瘤细胞发生坏死性凋亡,但具体机制仍未阐明。我们通过研究鼻咽癌患者病理活检标本、鼻咽癌5-8F BALB/c裸鼠移植瘤模型、人鼻咽低分化鳞状上皮癌5-8F细胞株,进一步探讨紫草素杀伤鼻咽癌细胞的具体机制,为临床上克服鼻咽癌治疗易发生耐药性的难题提供新的思路和解决方案。目的:通过对鼻咽癌患者病理活检标本、鼻咽癌5-8F BALB/c裸鼠移植瘤模型、人鼻咽低分化鳞状上皮癌5-8F细胞株,探讨RIPK1/RIPK3/MLKL通路在紫草素诱导“坏死性凋亡”杀伤鼻咽癌的具体机制。方法:1、通过免疫荧光染色法在激光共聚焦显微镜下观察鼻咽癌活检标本中RIPK1表达的改变。2、通过建立鼻咽癌5-8F BALB/c裸鼠移植瘤模型,研究紫草素在体内环境下对鼻咽癌细胞的杀伤作用。通过免疫组化染色法观察移植瘤中RIPK3的表达变化。3、通过CCK8法检测细胞生存率。4、通过透射电镜直接观察紫草素处理过的鼻咽癌5-8F细胞的形态学改变。5、通过流式学检测方法(Annexin V-FITC和PI双染)研究鼻咽癌细胞的死亡方式。6、通过DCFH-DA探针检测鼻咽癌细胞中的活性氧(ROS)生成水平的改变。7、通过免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测分析鼻咽癌细胞中坏死性凋亡关键调控蛋白RIPK1、RIPK3和MLKL分子的表达水平变化。结果:1、鼻咽癌活检组织标本免疫荧光结果显示RIPK1在鼻咽癌细胞质中表达。2、鼻咽癌5-8F BALB/c裸鼠移植瘤模型结果表明,相对于对照组,紫草素实验组的移植瘤体积和重量明显缩小,且免疫组织化学染色法观察到紫草素实验组移植瘤中RIPK3表达明显上调。3、CCK8法检测结果显示:在一定的浓度范围内,紫草素能够显著降低鼻咽癌5-8F细胞的生存率。4、透射电镜观察紫草素处理过的鼻咽癌5-8F细胞的形态学表现:细胞内电子密度降低、细胞膜完整性被破坏,核膜完整性丧失,提示发生了坏死性凋亡。流式细胞学测试结果同样证明紫草素诱导鼻咽癌细胞发生了坏死性凋亡。5、Western blotting结果显示紫草素作用下的鼻咽癌细胞中RIPK1、RIPK3和MLKL表达水平明显增高,且在一定范围内具有浓度依赖性,而且能被Nec-1或NAC抑制。6、DCFH-DA探针检测法可观察到紫草素能诱导鼻咽癌细胞中ROS过度生成,而Nec-1或NAC能抑制ROS过度生成。结论:紫草素通过RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路诱导“坏死性凋亡”途径杀伤鼻咽癌细胞,此过程中ROS的过度生成发挥重要的作用